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【摘 要】 目的：比较2005与2010年版《中国药典》肿节风中异秦皮啶含量测定方法的优劣。方法：分别按照2005和2010年版《中国药典》肿节风中异秦皮啶的样品处理方法处理同一批肿节风根、茎、叶样品，制备待测溶液，HPLC方法测定异秦皮啶的含量。结果：分别采用2005与2010年版《中国药典》的测定方法测得肿节风根、茎、叶中异秦皮啶平均含量分别为0.071 %，0.045 1%，0.025 3%和0.047 %，0.015 4%，0.0073%。结论： 2010年版方法测得异秦皮啶的含量显著低于2005年版方法，且灵敏度也显著低于2005版方法，建议对2010年版方法进行修订。
【关键词】 肿节风；《中国药典》；异秦皮啶；含量测定
Comparative Study on determination method’s differences of 2005 and 2010 Year Edition Pharmacopoeiaof People's Republic
of China about Sarcandra glabra’s isofraxidine content
SHI Ling-ling1, XIE Ru-gen2, ZHANG Yun-gen2, ZHANG Da-xing2, LIU Yu-jun1*, MA Chao1*
(1. Beijing Forestry University, Beijing 100083, China;2. Jiang le National Forest Farm, Fujian 350401, China )
【Abstract】Objective：To compare the methods in 2005 and 2010 Year Edition Pharmacopoeia of People's Republic of China for determination of isofraxidine in Sarcandra glabra. Method: HPLC was used to measure the content of isofraxidine in the same samples of roots, stems and leaves of Sarcandra glabra, after samples preparation according to 2005 and 2010 Year Edition Pharmacopoeia of People's Republic of China. Result: The average content of isofraxidine determined using the methods of 2005 and 2010 Year Edition Pharmacopoeia of People's Republic of China in roots, stems and leaves was 0.071 8%, 0.045 1% , 0.025 3% and 0.047 1%, 0.015 4%, 0.007 3% respectively. Conclusion:The content of isofraxidine determined using 2010 Year Edition method was significantly much lower than 2005 Year Edition, and the methods in 2010 Year Edition was suggested to be modified.
【Key words】 Sarcandra glabra; Pharmacopoeia of People's Republic of China; isofraxidine
肿节风（Sarcandra glabra）又名草珊瑚、九节茶、接骨木等，是金粟兰科（Chloranthaceae）植物草珊瑚Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai的干燥全草。肿节风味苦、辛，性平，具清热凉血、活血消斑、祛风通络等功效，临床用于治疗血热紫斑、紫癜、风湿痹痛、跌打损伤等症[1]。药理学研究发现，肿节风具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎镇痛等作用[2～7]。肿节风中含有的异秦皮啶在体外活性实验中显示出一定的抑制肿瘤细胞的作用[8]，因此常常将其作为肿节风质量控制的标识性成分。2000年版《中国药典》将异秦皮啶的含量作为草珊瑚药材及制剂的质量控制指标，2005年版《中国药典》规定草珊瑚中异秦皮啶的含量必须大于0.02%。2010年版《中国药典》对2005年版药典异秦皮啶的含量测定方法进行了简化，并增加了迷迭香酸的含量控制。但是作者在测定中发现，分别采用2005与2010年版药典方法测定异秦皮啶含量时，结果存在较大差异，为此作者对两种方法进行了对比研究。
1 材料
野生肿节风采于福建三明将乐林场，由北京林业大学程瑾副教授鉴定，样品用水冲洗干净后，放入烘箱60 ℃烘干，备用。
2 仪器与试剂
Shimadzu LC-20A HPLC色谱仪，配备SIL-20A Auto Sampler自动进样器，SPD-M20A Diode Array Detector检测器, CTO-10AS VP Column Oven柱温箱，LC Solution 色谱工作站。色谱纯乙腈购自上海国药试剂有限公司；异秦皮啶对照品，批号 070802，含量大于98%，购自上海融禾医药科技有限公司；水为Ⅰ级纯化水，其它试剂均为分析纯。
3 方法与结果
3.1 HPLC色谱条件及系统适用性考察
3.1.1 色谱条件 色谱柱Diamonsia C18 ( 250×416 mm, 5 μm)；流动相：乙腈- 0.1%磷酸(29∶71)，流速1.0 mL•min-1；检测波长342 nm；进样量10 μL。理论板数按异秦皮啶峰计算应不低于1200。
3.1.2 对照品溶液的制备 精密称取异秦皮啶对照品适量，加甲醇制成每 1 mL含4 µg的溶液，即得。
3.1.3 线性关系考察 精密称取异秦皮啶对照品，分别配制成1.0～10 μg•mL -1的系列浓度，然后吸取10 μL注入色谱仪, 测定峰面积，以异秦皮啶的浓度（μg•mL -1）为横坐标，峰面积的积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y= 39105X+ 4516, r = 0.999 8，异秦皮啶在1.0～10 μg•mL-1范围内呈良好的线性关系。
3.1.4 精密度试验 精密吸取异秦皮啶对照品溶液10 μL，依法测定6次, RSD为0.37%。
3.1.5 重现性试验 取样品1份，按照样品测定方法重复测定6次，测定异秦皮啶含量 RSD为1.29%。
3.2 供试品溶液的制备
3.2.1 2005年版《中国药典》供试品溶液的制备方法 取肿节风粉末(过三号筛)约0.4 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加水90 mL，静置过夜，超声处理(功率300 W，频率25 KHz) 1.5小时，取出，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，浓缩至近干，加水约5 mL溶解并转移至分液漏斗中，用三氯甲烷提取5次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
3.2.2 2005年版《中国药典》供试品溶液的制备方法 取肿节风粉末(过三号筛)约0.4 g，精密称定，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得
3.2.3 加样回收率试验 称取已知含量的样品6份，加入定量异秦皮啶对照品，分别依3.2.1与3.2.2方法进行样品处理，并采用HPLC测定样品中异秦皮啶含量，分别计算加样回收率，结果如表1所示。
3.3 样品测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定对应异秦皮啶峰面积，按照标准曲线计算异秦皮啶含量。其中，肿节风根、茎、叶对应的HPLC色谱图如图1、2所示，含量测定结果如表2所示。
表1 异秦皮啶加样回收率
平均回收率 % 根 茎 叶
2005版《中国药典》方法 101.33 101.29 99.87
2010版《中国药典》方法 101.87 99.38 98.36
图1. 2005年版《中国药典》异秦皮啶含量测定方法HPLC色谱图
A 根；B 茎；C 叶；D 对照品
图2. 2010年版《中国药典》异秦皮啶含量测定方法HPLC色谱图
E 根；F 茎；G 叶；D 对照品
由以上图1和图2可以看出，采用2005年版《中国药典》方法进行样品处理后，HPLC测得的异秦皮啶峰形好，干扰性杂质较少，异秦皮啶为其中的主要检出峰；但采用2010年《中国药典》方法进行样品处理后，HPLC测得的异秦皮啶峰形极小，尤其在含量较低的茎和叶中几乎无法检出，杂质峰较多，且峰面积极大，严重影响了异秦皮啶峰的检出灵敏度。因此，尽管2010年版采用的样品处理方法相对于2005版方法简单，耗时较短，但是样品中干扰成分多，尤其对含量较低的茎、叶样品，检出灵敏度较低。
表2 2005年版与2010年版《中国药典》方法测得肿节风根茎叶中异秦皮啶含量
样品处理方法 平均含量 / %
根 茎 叶
2005版《中国药典》方法 0.071 0.0451 0.0253
2010版《中国药典》方法 0.047 0.0154 0.0073
从表2可以看出，分别采用2005年版与2010年版方法测定所得的肿节风根茎叶中异秦皮啶含量存在显著差异，且样品中含量越低，其相对偏差越大。采用2010年版方法测得的含量明显低于2005年版方法。2005年版与2010年版《中国药典》均规定肿节风中异秦皮啶的含量不低于0.02%，如果按照2005年版方法测定，肿节风根、茎、叶部位均符合要求，但是如果按照2010年版方法测定，只有根中含量大于0.02%，符合要求，而茎和叶中含量均不合格。
4 讨论
肿节风药材质量标准的含量测定项要求采用HPLC法测定异秦皮啶的含量[9]，并要求按干燥品计算，异秦皮啶的含量不得少于0.020％。2010年版《中国药典》肿节风中异秦皮啶含量测定方法较2005年版有了较大的简化，操作更为简单，耗时也大大缩短。但本文研究发现，采用2010年版药典方法进行样品处理时，样品的检出灵敏度明显低于2005年版方法，尤其是对含量较低的茎叶部位，干扰峰和杂质峰多且含量较高，导致其测定误差大，测得的含量明显低于2005年版方法，给药材的质量评价带来很大困扰。因此，我们建议对2010年版《中国药典》肿节风含量测定项下的样品处理方法进行修订，在没有更好的方法之前，可以暂时沿用2005年版方法。
参考文献
[1]Zou Chengting，Yang Xiuwei. A New Iridoid Glucoside from Ningpo Figwort(Scrophularia ningpoensis) Root[J]. 2000，31 (4)：241
[2] 梅全喜，胡 莹. 肿节风的药理作用及临床应用研究进展[J]. 时珍国医国药，2011，22 (3)：230
[3] 崔 英, 邝国乾, 岳惠芬, 等. 中草药抑制EB病毒壳抗原在体外细胞中表达的实验研究[J] . 四川肿瘤防治, 2001, 14(3)：148.
[4] 苏 敏, 章志强, 邓玉清, 等, 肿节风总黄酮对小鼠肉瘤S180的抑瘤作用[ J] , 西北药学杂志, 2009，24(4)：272.
[5] 黄 芳, 何宏文. 九节茶对变形链球菌体外致龋力的实验研究[J] .中国民政医学杂志, 2001，13( 4 )： 201
[6] 朱元昌. 肿节风中微量元素在治疗中的作用[J] . 中成药，199 l，(12)： 47
[7] 蒋伟哲, 孙晓龙. 肿节风片的抗菌和抗炎作用研究[J]. 广西中医学院学报, 2000, 17(1)：50.
[8] 康 敏, 唐安洲, 梁 钢等. 肿节风提取物抑制鼻咽癌细胞增殖的实验研究[J]. 广西医科大学学报, 2008，25 (3)：347.
[9] 黄美霞，章 靓，陈 旺等. 闽产草珊瑚中异秦皮啶含量测定方法研究[J]. 中国民族民间医药，2010，(2)：15
【关键词】 肿节风；《中国药典》；异秦皮啶；含量测定
Comparative Study on determination method’s differences of 2005 and 2010 Year Edition Pharmacopoeiaof People's Republic
of China about Sarcandra glabra’s isofraxidine content
SHI Ling-ling1, XIE Ru-gen2, ZHANG Yun-gen2, ZHANG Da-xing2, LIU Yu-jun1*, MA Chao1*
(1. Beijing Forestry University, Beijing 100083, China;2. Jiang le National Forest Farm, Fujian 350401, China )
【Abstract】Objective：To compare the methods in 2005 and 2010 Year Edition Pharmacopoeia of People's Republic of China for determination of isofraxidine in Sarcandra glabra. Method: HPLC was used to measure the content of isofraxidine in the same samples of roots, stems and leaves of Sarcandra glabra, after samples preparation according to 2005 and 2010 Year Edition Pharmacopoeia of People's Republic of China. Result: The average content of isofraxidine determined using the methods of 2005 and 2010 Year Edition Pharmacopoeia of People's Republic of China in roots, stems and leaves was 0.071 8%, 0.045 1% , 0.025 3% and 0.047 1%, 0.015 4%, 0.007 3% respectively. Conclusion:The content of isofraxidine determined using 2010 Year Edition method was significantly much lower than 2005 Year Edition, and the methods in 2010 Year Edition was suggested to be modified.
【Key words】 Sarcandra glabra; Pharmacopoeia of People's Republic of China; isofraxidine
肿节风（Sarcandra glabra）又名草珊瑚、九节茶、接骨木等，是金粟兰科（Chloranthaceae）植物草珊瑚Sarcandra glabra (Thunb.) Nakai的干燥全草。肿节风味苦、辛，性平，具清热凉血、活血消斑、祛风通络等功效，临床用于治疗血热紫斑、紫癜、风湿痹痛、跌打损伤等症[1]。药理学研究发现，肿节风具有抗癌、抗菌、抗病毒、抗炎镇痛等作用[2～7]。肿节风中含有的异秦皮啶在体外活性实验中显示出一定的抑制肿瘤细胞的作用[8]，因此常常将其作为肿节风质量控制的标识性成分。2000年版《中国药典》将异秦皮啶的含量作为草珊瑚药材及制剂的质量控制指标，2005年版《中国药典》规定草珊瑚中异秦皮啶的含量必须大于0.02%。2010年版《中国药典》对2005年版药典异秦皮啶的含量测定方法进行了简化，并增加了迷迭香酸的含量控制。但是作者在测定中发现，分别采用2005与2010年版药典方法测定异秦皮啶含量时，结果存在较大差异，为此作者对两种方法进行了对比研究。
1 材料
野生肿节风采于福建三明将乐林场，由北京林业大学程瑾副教授鉴定，样品用水冲洗干净后，放入烘箱60 ℃烘干，备用。
2 仪器与试剂
Shimadzu LC-20A HPLC色谱仪，配备SIL-20A Auto Sampler自动进样器，SPD-M20A Diode Array Detector检测器, CTO-10AS VP Column Oven柱温箱，LC Solution 色谱工作站。色谱纯乙腈购自上海国药试剂有限公司；异秦皮啶对照品，批号 070802，含量大于98%，购自上海融禾医药科技有限公司；水为Ⅰ级纯化水，其它试剂均为分析纯。
3 方法与结果
3.1 HPLC色谱条件及系统适用性考察
3.1.1 色谱条件 色谱柱Diamonsia C18 ( 250×416 mm, 5 μm)；流动相：乙腈- 0.1%磷酸(29∶71)，流速1.0 mL•min-1；检测波长342 nm；进样量10 μL。理论板数按异秦皮啶峰计算应不低于1200。
3.1.2 对照品溶液的制备 精密称取异秦皮啶对照品适量，加甲醇制成每 1 mL含4 µg的溶液，即得。
3.1.3 线性关系考察 精密称取异秦皮啶对照品，分别配制成1.0～10 μg•mL -1的系列浓度，然后吸取10 μL注入色谱仪, 测定峰面积，以异秦皮啶的浓度（μg•mL -1）为横坐标，峰面积的积分值为纵坐标，绘制标准曲线，得回归方程为Y= 39105X+ 4516, r = 0.999 8，异秦皮啶在1.0～10 μg•mL-1范围内呈良好的线性关系。
3.1.4 精密度试验 精密吸取异秦皮啶对照品溶液10 μL，依法测定6次, RSD为0.37%。
3.1.5 重现性试验 取样品1份，按照样品测定方法重复测定6次，测定异秦皮啶含量 RSD为1.29%。
3.2 供试品溶液的制备
3.2.1 2005年版《中国药典》供试品溶液的制备方法 取肿节风粉末(过三号筛)约0.4 g，精密称定，置100 mL量瓶中，加水90 mL，静置过夜，超声处理(功率300 W，频率25 KHz) 1.5小时，取出，放冷，用水稀释至刻度，摇匀，滤过，精密量取续滤液25 mL，浓缩至近干，加水约5 mL溶解并转移至分液漏斗中，用三氯甲烷提取5次，每次10 mL，合并三氯甲烷液，蒸干，残渣加甲醇溶解并转移至10 mL量瓶中，加甲醇至刻度，摇匀，即得。
3.2.2 2005年版《中国药典》供试品溶液的制备方法 取肿节风粉末(过三号筛)约0.4 g，精密称定，精密加入甲醇25 mL，密塞，称定重量，加热回流1小时，放冷，再称定重量，用甲醇补足减失的重量，摇匀，滤过，取续滤液，即得
3.2.3 加样回收率试验 称取已知含量的样品6份，加入定量异秦皮啶对照品，分别依3.2.1与3.2.2方法进行样品处理，并采用HPLC测定样品中异秦皮啶含量，分别计算加样回收率，结果如表1所示。
3.3 样品测定法 分别精密吸取对照品溶液与供试品溶液各10 μL，注入液相色谱仪，测定对应异秦皮啶峰面积，按照标准曲线计算异秦皮啶含量。其中，肿节风根、茎、叶对应的HPLC色谱图如图1、2所示，含量测定结果如表2所示。
表1 异秦皮啶加样回收率
平均回收率 % 根 茎 叶
2005版《中国药典》方法 101.33 101.29 99.87
2010版《中国药典》方法 101.87 99.38 98.36
图1. 2005年版《中国药典》异秦皮啶含量测定方法HPLC色谱图
A 根；B 茎；C 叶；D 对照品
图2. 2010年版《中国药典》异秦皮啶含量测定方法HPLC色谱图
E 根；F 茎；G 叶；D 对照品
由以上图1和图2可以看出，采用2005年版《中国药典》方法进行样品处理后，HPLC测得的异秦皮啶峰形好，干扰性杂质较少，异秦皮啶为其中的主要检出峰；但采用2010年《中国药典》方法进行样品处理后，HPLC测得的异秦皮啶峰形极小，尤其在含量较低的茎和叶中几乎无法检出，杂质峰较多，且峰面积极大，严重影响了异秦皮啶峰的检出灵敏度。因此，尽管2010年版采用的样品处理方法相对于2005版方法简单，耗时较短，但是样品中干扰成分多，尤其对含量较低的茎、叶样品，检出灵敏度较低。
表2 2005年版与2010年版《中国药典》方法测得肿节风根茎叶中异秦皮啶含量
样品处理方法 平均含量 / %
根 茎 叶
2005版《中国药典》方法 0.071 0.0451 0.0253
2010版《中国药典》方法 0.047 0.0154 0.0073
从表2可以看出，分别采用2005年版与2010年版方法测定所得的肿节风根茎叶中异秦皮啶含量存在显著差异，且样品中含量越低，其相对偏差越大。采用2010年版方法测得的含量明显低于2005年版方法。2005年版与2010年版《中国药典》均规定肿节风中异秦皮啶的含量不低于0.02%，如果按照2005年版方法测定，肿节风根、茎、叶部位均符合要求，但是如果按照2010年版方法测定，只有根中含量大于0.02%，符合要求，而茎和叶中含量均不合格。
4 讨论
肿节风药材质量标准的含量测定项要求采用HPLC法测定异秦皮啶的含量[9]，并要求按干燥品计算，异秦皮啶的含量不得少于0.020％。2010年版《中国药典》肿节风中异秦皮啶含量测定方法较2005年版有了较大的简化，操作更为简单，耗时也大大缩短。但本文研究发现，采用2010年版药典方法进行样品处理时，样品的检出灵敏度明显低于2005年版方法，尤其是对含量较低的茎叶部位，干扰峰和杂质峰多且含量较高，导致其测定误差大，测得的含量明显低于2005年版方法，给药材的质量评价带来很大困扰。因此，我们建议对2010年版《中国药典》肿节风含量测定项下的样品处理方法进行修订，在没有更好的方法之前，可以暂时沿用2005年版方法。
参考文献
[1]Zou Chengting，Yang Xiuwei. A New Iridoid Glucoside from Ningpo Figwort(Scrophularia ningpoensis) Root[J]. 2000，31 (4)：241
[2] 梅全喜，胡 莹. 肿节风的药理作用及临床应用研究进展[J]. 时珍国医国药，2011，22 (3)：230
[3] 崔 英, 邝国乾, 岳惠芬, 等. 中草药抑制EB病毒壳抗原在体外细胞中表达的实验研究[J] . 四川肿瘤防治, 2001, 14(3)：148.
[4] 苏 敏, 章志强, 邓玉清, 等, 肿节风总黄酮对小鼠肉瘤S180的抑瘤作用[ J] , 西北药学杂志, 2009，24(4)：272.
[5] 黄 芳, 何宏文. 九节茶对变形链球菌体外致龋力的实验研究[J] .中国民政医学杂志, 2001，13( 4 )： 201
[6] 朱元昌. 肿节风中微量元素在治疗中的作用[J] . 中成药，199 l，(12)： 47
[7] 蒋伟哲, 孙晓龙. 肿节风片的抗菌和抗炎作用研究[J]. 广西中医学院学报, 2000, 17(1)：50.
[8] 康 敏, 唐安洲, 梁 钢等. 肿节风提取物抑制鼻咽癌细胞增殖的实验研究[J]. 广西医科大学学报, 2008，25 (3)：347.
[9] 黄美霞，章 靓，陈 旺等. 闽产草珊瑚中异秦皮啶含量测定方法研究[J]. 中国民族民间医药，2010，(2)：15