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[摘要]脂肪来源干细胞（adipose-derived stem cells， ADSCs）是一类存在脂肪组织中，具有多向分化潜能的干细胞。由于其获取简便，不易造成供区畸形，且与胚胎干细胞相比更加安全等原因，现已在各个领域得到广泛应用。迄今ADSCs在抗皮肤老化方面的作用已被多个体外实验及动物实验证实。而如何将ADSCs的组织更新能力应用于临床，完成干细胞的转化一直是近年来研究的热点。本文对ADSCs改善老化皮肤质地的实验研究和临床应用进展进行综述。
[关键词]脂肪来源干细胞;皮肤老化;纳米脂肪;脂肪干细胞胶;面部年轻化
[中图分类号]R339.3+8 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2020）05-0187-03
Abstract： Adipose-derived stem cells ADSCs is a kind of pluripotent stem cells that locates in fat tissue. Since ADSCs can be easily obtained， rarely result in donor site deformity and the lower tumorigenicity when compared with embryonic stem cells， ADSCs is widely applicated in various areas. So far， the potential of ADSCs in skin rejuvenation is proved by several vitro and animal experiments. How to take a full advantage of the ADSCs to rejuvenate skin in clinical has been the hotspot recently. In this paper， we reviewed the experiments and clinical researches that utilized ADSCs to improve the quality of aging skin.
Key words：adipose-derived stem cells;skin aging;nanofat;svf-gel;skin rejuvenation
自1893年Neuber首次应用小块脂肪治疗软组织缺损以来，脂肪作为一个新兴的填充材料逐渐被广泛应用。2001年，Zuk等[1]初次在脂肪组织中发现一群具有多向分化潜能的干细胞，命名为脂肪来源干细胞。迄今ADSCs的抗老化作用已被多个体外實验以及动物实验证实[2-3]。如何将ADSCs的组织更新能力应用于临床，完成干细胞的转化一直是近年来研究的热点。本文对ADSCs改善老化皮肤质地的实验研究和临床应用进展进行综述。
1 皮肤老化
皮肤老化是一个同时受到多种因素影响的复杂的生理过程，外在主要表现为皮肤弹性下降、屏障功能减弱、皱纹增加、表皮和真皮变薄及色素沉积等[4]。影响因素包括内源性因素，例如机体自身结构性因素，以及外源性因素，例如紫外线照射（又称光老化）、环境污染、化学物质等[5]。 皮肤中血管分布减少、水合能力下降、肥大细胞和成纤维细胞数量减少，角质细胞增殖速度下降等组织学变化，最终表现为皮肤外在的老化[6]。
2 ADSCs的抗衰老作用
2.1 影响胶原合成功能：无论是内源性或外源性因素都可以造成真皮中胶原及弹性纤维合成减少以及过度分解，这是造成皮肤弹性降低、产生皱纹的主要原因之一。Kim等[7]将ADSCs注射至受UVB照射的小鼠真皮内，发现ADSCs能显著减轻紫外线照射形成的皱纹，经测量发现真皮厚度和其中胶原含量显著增加。同一实验中，将ADSCs的培养上清液（ADSC- conditioned medium，ADSC-CM）与人真皮成纤维细胞（human dermal fibroblast，HDF）共同培养，ADSC-CM可减少紫外线照射所导致的人成纤维细胞凋亡，增加胶原含量并减少基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）含量。这证实了ADSCs旁分泌的细胞因子的抗衰老作用，ADSCs可分泌多种细胞因子及抗炎因子，如：血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）、造血生长因子（hepatocyte growth factor，HGF） 以及转录生长因子-β1 （transforming growth factor-β1 ，TGF-β1 ）等[8]。Noordam等[9]对617个对象调查发现，血清内IFG-1的水平与面部皱纹情况有关，这可能是由于IFG-1能抑制MMP-1的表达、上调胶原的产生[9]。除上述细胞因子外，脂肪细胞分泌的脂连蛋白及瘦素，可促进成纤维细胞产生透明质酸（hyaluronic acid，HA）以及胶原，调节皮肤状态[10]。除对光老化有抗衰作用以外，ADSCs移植能增加D-半乳糖（D-gal）诱导的自然老化模型小鼠皮肤内胶原含量，这一作用可能与ADSCs抑制一些衰老相关分子表达有关[11]。
2.2 影响血管生成：皮肤老化中皮肤血管改变也是重要的一环。皮肤血管老化可使皮肤对外界刺激反应性减低、皮肤颜色苍白、皮温降低以及皮肤营养滋润度降低。实验证实，ADSCs在无血清情况下可分化为血管内皮细胞[12]。Suga等[13]将ADSCs与脂肪共同移植，ADSCs能优先聚集于缺血区域，起到促血管新生的作用，为组织提供营养，共同移植的脂肪组织中VEGF和HGF含量明显增多。在此实验中也同时发现移植于组织的ADSCs在28d后基本已经消失，无法检测。而在体外实验中应用ADSC-CM也同样能促进血管网形成，这说明ADSCs的分化作用可能在促进血管化的过程中起到暂时性作用，而旁分泌的细胞因子相对作用持久。 2.3 影响黑色素代谢：ADSCs具有一定美白功效，是通过影响皮肤中黑色素代谢实现的。kim等[14]在B16黑素瘤细胞的体外实验中，证实ADSCs旁分泌的TGF-β1 可作用于黑色素合成通路，抑制酪氨酸酶及其相关蛋白的表达，最终抑制黑色素生成。Chang等[15]在动物实验中也获得了相似的结果，C57BL/6小鼠真皮下注射ADSCs后，可有效抑制紫外线照射引起的黑色素生成。
3 ADSCs改善老化皮肤质地的临床应用
3.1 ADSCs及ADSC-CM：现阶段ADSCs的分离培养方法可分为两种，组织块培养法和酶消化法。前者是将组织剪成小块后接种于培养瓶中，在接种后5～7d移除脂肪组织后可见细胞生长，此方法适用于组织量较少的原代培养，缺点是耗时较长;后者是将抽取的脂肪用胶原酶处理后，对悬液进行培养，此方法可在短时间内得到大量细胞，但花费较昂贵[16]。虽然ADSCs是许多类型细胞的前体细胞，但其更主要的作用是对周围细胞的信号传导作用，因此相对于其他干细胞，ADSCs的应用较为安全，致肿瘤性低[17]。Pak等[3]将含有20%～30% ADSCs的悬浊液注射至1例患者真皮内，可观察到皱纹减轻、皮肤质地改善。ADSC-CM作为ADSCs培养的副产物，内含多种细胞因子，在小鼠实验中已被证明具有抗光老化以及抗皱作用。由于ADSC-CM其中不含活细胞，注射于人体不涉及伦理问题，临床应用范围更加广泛。Wang等[18]将ADSCs培养液蛋白提取物利用微针注射于面部，进行随机双盲半脸对照研究。结果显示相对于使用超纯水的对照侧，治疗侧在黑素指数、皮肤光泽度、皮肤粗糙度、弹性及皱纹改善方面均有明显提升。ADSC-CM也可与二氧化碳点阵激光联合应用，可增加皮肤弹性、使皮肤平滑以及减少二氧化碳点阵激光后色素沉着的情况[19]。
3.2 纳米脂肪：纳米脂肪是在2013年首次由Tonnard[20]所描述，是一种经过机械处理的乳糜样脂肪。将抽取的颗粒脂肪通过两只10ml注射器通过female-to-female的luer-lock互相推注30次以上，用棉布过滤，得到的即是纳米脂肪。纳米脂肪的主要成分是大量乳化的油脂，其中几乎已无成熟脂肪细胞。对纳米脂肪分离培养后，10～12d可见ADSCs聚集，从纳米脂肪中提取的ADSCs 与常规方法相比，形态与生长速度无明显差距[21]。由于纳米脂肪颗粒极细，可通过27g针头注射于面颈部精细部位，对于眼下色素沉积及面颈部皱纹改善效果明显。纳米脂肪还可通过微针注射于面部，微针可在皮下形成微细孔道，将纳米脂肪中的ADSCs成分有效导入皮下，并能刺激胶原蛋白产生，最终改善细纹[22]。Liang等[21]将纳米脂肪和富血小板纤维蛋白（Platelet-Rich Fibrin，PRF）联合应用精细注射于皮下，与注射透明质酸的对照组相比，纳米脂肪联合PRF组患者满意率更高。早期PRF可起到促进纳米脂肪中ADSCs增殖的作用，使ADSCs持续释放VEGF、bFGF、EGF等生长因子。Peng Xu等[23]将纳米脂肪注射于光老化小鼠背部，与注射PBS对照组相比，真皮厚度及血管化明显增加，但与注射ADSCs的小鼠相比，作用稍弱。
3.3 脂肪干细胞胶（ecm/Svf-gel）：纳米脂肪是一种利用机械乳化方法提取血管基质成分（Stromal Vascular Fraction，Svf）的方法，无需应用外源试剂，但纳米脂肪中仍含有大量的油脂和肿胀液，杂质的存在不仅降低了干细胞浓度，且可能与纳米脂肪注射后红斑的形成有关。Yao等[24]对纳米脂肪进行进一步处理，通过物理方法去除其中的油脂等无效成分，得到了更加浓缩的产物称之为脂肪干细胞胶。制备完成的脂肪干細胞胶需满足如下标准：①最终体积<初始体积的15%;②Svf细胞浓度>4.0×105 cells/ml;③终产物可通过27g针头进行注射。细胞分析显示Svf-gel中ADSCs的含量与颗粒脂肪无统计学差别，但由于体积缩小至十分之一，最终产物中ADSCs含量高度浓缩。将Svf-gel 注射于眶周暗沉区及鱼尾纹区域真皮下，细纹和暗沉得到明显改善，未见脂肪团块[25]。与纳米脂肪不同的是，Svf-gel的应用不局限于改善面部皱纹及皮肤质地，其仍可作为一种自体材料应用于面部凹陷填充[26]。
4 讨论
老化皮肤肤质的变化主要表现在水分减少、皱纹增多、色素沉积等。经过近些年对ADSCs不断深入的探究，发现其在抗衰老方面具有许多的优势：①与其他干细胞相比更易于获取，不造成供区部位的缺损，并且含量丰富;②相对于胚胎干细胞来说，伦理问题小;③致瘤风险相对较小。ADSCs的临床应用可分为两类：一是在实验室条件下对脂肪进行分解、培养、扩增，得到的ADSCs或ADSC-CM都可应用于真皮注射;另一类是利用物理方法处理脂肪，机械破坏脂肪细胞，例如：纳米脂肪和脂肪干细胞胶。Charles-de-Sá等[27]比较了这两种方法，两者对皮肤产生的影响无明显差别，唯一不同点是ADSCs组在真皮网状层和皮下组织的交界可发现较多脂肪组织。但第二种方法无需加入额外的试剂，减少了产物污染的风险，可以节省时间及金钱。ADSCs的抗衰老作用已在多个动物实验和临床应用中证实，但仍有一些不足之处。首先干细胞自身具有局限性，随着年龄增长，ADSCs的增殖和分化活力可能有所下降[28]，这就限制了脂肪干细胞在抗衰老中的实际应用。近年来，对冻存ADSCs 的研究逐渐增多，有实验证据表明，冻存ADSCs仍可用于小鼠烧伤伤口的覆盖，显示出与新鲜脂肪干细胞相似的促愈合能力[29]。这为今后干细胞研究提供了方向，可以通过建立“脂肪银行”，冻存年轻的干细胞用于面部年轻化以及治疗疾病。另一个亟待解决的问题是如何从脂肪组织中培养出更高活性的ADSCs或Svf，临床上的操作流程尚未有固定的标准。虽通过一系列体内外实验对ADSCs对抗自然老化以及光老化的通路有了初步了解，但仍有一些机制未明，需更深入的研究来丰富大家的认识，更好地指导临床应用。 [參考文献]
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[收稿日期]2019-08-19
本文引用格式：李嘉欣，陈伟华.脂肪来源干细胞在改善老化皮肤质地中的作用及其临床应用[J].中国美容医学，2020，29（5）：187-189.
[关键词]脂肪来源干细胞;皮肤老化;纳米脂肪;脂肪干细胞胶;面部年轻化
[中图分类号]R339.3+8 [文献标志码]A [文章编号]1008-6455（2020）05-0187-03
Abstract： Adipose-derived stem cells ADSCs is a kind of pluripotent stem cells that locates in fat tissue. Since ADSCs can be easily obtained， rarely result in donor site deformity and the lower tumorigenicity when compared with embryonic stem cells， ADSCs is widely applicated in various areas. So far， the potential of ADSCs in skin rejuvenation is proved by several vitro and animal experiments. How to take a full advantage of the ADSCs to rejuvenate skin in clinical has been the hotspot recently. In this paper， we reviewed the experiments and clinical researches that utilized ADSCs to improve the quality of aging skin.
Key words：adipose-derived stem cells;skin aging;nanofat;svf-gel;skin rejuvenation
自1893年Neuber首次应用小块脂肪治疗软组织缺损以来，脂肪作为一个新兴的填充材料逐渐被广泛应用。2001年，Zuk等[1]初次在脂肪组织中发现一群具有多向分化潜能的干细胞，命名为脂肪来源干细胞。迄今ADSCs的抗老化作用已被多个体外實验以及动物实验证实[2-3]。如何将ADSCs的组织更新能力应用于临床，完成干细胞的转化一直是近年来研究的热点。本文对ADSCs改善老化皮肤质地的实验研究和临床应用进展进行综述。
1 皮肤老化
皮肤老化是一个同时受到多种因素影响的复杂的生理过程，外在主要表现为皮肤弹性下降、屏障功能减弱、皱纹增加、表皮和真皮变薄及色素沉积等[4]。影响因素包括内源性因素，例如机体自身结构性因素，以及外源性因素，例如紫外线照射（又称光老化）、环境污染、化学物质等[5]。 皮肤中血管分布减少、水合能力下降、肥大细胞和成纤维细胞数量减少，角质细胞增殖速度下降等组织学变化，最终表现为皮肤外在的老化[6]。
2 ADSCs的抗衰老作用
2.1 影响胶原合成功能：无论是内源性或外源性因素都可以造成真皮中胶原及弹性纤维合成减少以及过度分解，这是造成皮肤弹性降低、产生皱纹的主要原因之一。Kim等[7]将ADSCs注射至受UVB照射的小鼠真皮内，发现ADSCs能显著减轻紫外线照射形成的皱纹，经测量发现真皮厚度和其中胶原含量显著增加。同一实验中，将ADSCs的培养上清液（ADSC- conditioned medium，ADSC-CM）与人真皮成纤维细胞（human dermal fibroblast，HDF）共同培养，ADSC-CM可减少紫外线照射所导致的人成纤维细胞凋亡，增加胶原含量并减少基质金属蛋白酶（matrix metalloproteinase-1，MMP-1）含量。这证实了ADSCs旁分泌的细胞因子的抗衰老作用，ADSCs可分泌多种细胞因子及抗炎因子，如：血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）、胰岛素样生长因子（insulin-like growth factor，IGF）、造血生长因子（hepatocyte growth factor，HGF） 以及转录生长因子-β1 （transforming growth factor-β1 ，TGF-β1 ）等[8]。Noordam等[9]对617个对象调查发现，血清内IFG-1的水平与面部皱纹情况有关，这可能是由于IFG-1能抑制MMP-1的表达、上调胶原的产生[9]。除上述细胞因子外，脂肪细胞分泌的脂连蛋白及瘦素，可促进成纤维细胞产生透明质酸（hyaluronic acid，HA）以及胶原，调节皮肤状态[10]。除对光老化有抗衰作用以外，ADSCs移植能增加D-半乳糖（D-gal）诱导的自然老化模型小鼠皮肤内胶原含量，这一作用可能与ADSCs抑制一些衰老相关分子表达有关[11]。
2.2 影响血管生成：皮肤老化中皮肤血管改变也是重要的一环。皮肤血管老化可使皮肤对外界刺激反应性减低、皮肤颜色苍白、皮温降低以及皮肤营养滋润度降低。实验证实，ADSCs在无血清情况下可分化为血管内皮细胞[12]。Suga等[13]将ADSCs与脂肪共同移植，ADSCs能优先聚集于缺血区域，起到促血管新生的作用，为组织提供营养，共同移植的脂肪组织中VEGF和HGF含量明显增多。在此实验中也同时发现移植于组织的ADSCs在28d后基本已经消失，无法检测。而在体外实验中应用ADSC-CM也同样能促进血管网形成，这说明ADSCs的分化作用可能在促进血管化的过程中起到暂时性作用，而旁分泌的细胞因子相对作用持久。 2.3 影响黑色素代谢：ADSCs具有一定美白功效，是通过影响皮肤中黑色素代谢实现的。kim等[14]在B16黑素瘤细胞的体外实验中，证实ADSCs旁分泌的TGF-β1 可作用于黑色素合成通路，抑制酪氨酸酶及其相关蛋白的表达，最终抑制黑色素生成。Chang等[15]在动物实验中也获得了相似的结果，C57BL/6小鼠真皮下注射ADSCs后，可有效抑制紫外线照射引起的黑色素生成。
3 ADSCs改善老化皮肤质地的临床应用
3.1 ADSCs及ADSC-CM：现阶段ADSCs的分离培养方法可分为两种，组织块培养法和酶消化法。前者是将组织剪成小块后接种于培养瓶中，在接种后5～7d移除脂肪组织后可见细胞生长，此方法适用于组织量较少的原代培养，缺点是耗时较长;后者是将抽取的脂肪用胶原酶处理后，对悬液进行培养，此方法可在短时间内得到大量细胞，但花费较昂贵[16]。虽然ADSCs是许多类型细胞的前体细胞，但其更主要的作用是对周围细胞的信号传导作用，因此相对于其他干细胞，ADSCs的应用较为安全，致肿瘤性低[17]。Pak等[3]将含有20%～30% ADSCs的悬浊液注射至1例患者真皮内，可观察到皱纹减轻、皮肤质地改善。ADSC-CM作为ADSCs培养的副产物，内含多种细胞因子，在小鼠实验中已被证明具有抗光老化以及抗皱作用。由于ADSC-CM其中不含活细胞，注射于人体不涉及伦理问题，临床应用范围更加广泛。Wang等[18]将ADSCs培养液蛋白提取物利用微针注射于面部，进行随机双盲半脸对照研究。结果显示相对于使用超纯水的对照侧，治疗侧在黑素指数、皮肤光泽度、皮肤粗糙度、弹性及皱纹改善方面均有明显提升。ADSC-CM也可与二氧化碳点阵激光联合应用，可增加皮肤弹性、使皮肤平滑以及减少二氧化碳点阵激光后色素沉着的情况[19]。
3.2 纳米脂肪：纳米脂肪是在2013年首次由Tonnard[20]所描述，是一种经过机械处理的乳糜样脂肪。将抽取的颗粒脂肪通过两只10ml注射器通过female-to-female的luer-lock互相推注30次以上，用棉布过滤，得到的即是纳米脂肪。纳米脂肪的主要成分是大量乳化的油脂，其中几乎已无成熟脂肪细胞。对纳米脂肪分离培养后，10～12d可见ADSCs聚集，从纳米脂肪中提取的ADSCs 与常规方法相比，形态与生长速度无明显差距[21]。由于纳米脂肪颗粒极细，可通过27g针头注射于面颈部精细部位，对于眼下色素沉积及面颈部皱纹改善效果明显。纳米脂肪还可通过微针注射于面部，微针可在皮下形成微细孔道，将纳米脂肪中的ADSCs成分有效导入皮下，并能刺激胶原蛋白产生，最终改善细纹[22]。Liang等[21]将纳米脂肪和富血小板纤维蛋白（Platelet-Rich Fibrin，PRF）联合应用精细注射于皮下，与注射透明质酸的对照组相比，纳米脂肪联合PRF组患者满意率更高。早期PRF可起到促进纳米脂肪中ADSCs增殖的作用，使ADSCs持续释放VEGF、bFGF、EGF等生长因子。Peng Xu等[23]将纳米脂肪注射于光老化小鼠背部，与注射PBS对照组相比，真皮厚度及血管化明显增加，但与注射ADSCs的小鼠相比，作用稍弱。
3.3 脂肪干细胞胶（ecm/Svf-gel）：纳米脂肪是一种利用机械乳化方法提取血管基质成分（Stromal Vascular Fraction，Svf）的方法，无需应用外源试剂，但纳米脂肪中仍含有大量的油脂和肿胀液，杂质的存在不仅降低了干细胞浓度，且可能与纳米脂肪注射后红斑的形成有关。Yao等[24]对纳米脂肪进行进一步处理，通过物理方法去除其中的油脂等无效成分，得到了更加浓缩的产物称之为脂肪干细胞胶。制备完成的脂肪干細胞胶需满足如下标准：①最终体积<初始体积的15%;②Svf细胞浓度>4.0×105 cells/ml;③终产物可通过27g针头进行注射。细胞分析显示Svf-gel中ADSCs的含量与颗粒脂肪无统计学差别，但由于体积缩小至十分之一，最终产物中ADSCs含量高度浓缩。将Svf-gel 注射于眶周暗沉区及鱼尾纹区域真皮下，细纹和暗沉得到明显改善，未见脂肪团块[25]。与纳米脂肪不同的是，Svf-gel的应用不局限于改善面部皱纹及皮肤质地，其仍可作为一种自体材料应用于面部凹陷填充[26]。
4 讨论
老化皮肤肤质的变化主要表现在水分减少、皱纹增多、色素沉积等。经过近些年对ADSCs不断深入的探究，发现其在抗衰老方面具有许多的优势：①与其他干细胞相比更易于获取，不造成供区部位的缺损，并且含量丰富;②相对于胚胎干细胞来说，伦理问题小;③致瘤风险相对较小。ADSCs的临床应用可分为两类：一是在实验室条件下对脂肪进行分解、培养、扩增，得到的ADSCs或ADSC-CM都可应用于真皮注射;另一类是利用物理方法处理脂肪，机械破坏脂肪细胞，例如：纳米脂肪和脂肪干细胞胶。Charles-de-Sá等[27]比较了这两种方法，两者对皮肤产生的影响无明显差别，唯一不同点是ADSCs组在真皮网状层和皮下组织的交界可发现较多脂肪组织。但第二种方法无需加入额外的试剂，减少了产物污染的风险，可以节省时间及金钱。ADSCs的抗衰老作用已在多个动物实验和临床应用中证实，但仍有一些不足之处。首先干细胞自身具有局限性，随着年龄增长，ADSCs的增殖和分化活力可能有所下降[28]，这就限制了脂肪干细胞在抗衰老中的实际应用。近年来，对冻存ADSCs 的研究逐渐增多，有实验证据表明，冻存ADSCs仍可用于小鼠烧伤伤口的覆盖，显示出与新鲜脂肪干细胞相似的促愈合能力[29]。这为今后干细胞研究提供了方向，可以通过建立“脂肪银行”，冻存年轻的干细胞用于面部年轻化以及治疗疾病。另一个亟待解决的问题是如何从脂肪组织中培养出更高活性的ADSCs或Svf，临床上的操作流程尚未有固定的标准。虽通过一系列体内外实验对ADSCs对抗自然老化以及光老化的通路有了初步了解，但仍有一些机制未明，需更深入的研究来丰富大家的认识，更好地指导临床应用。 [參考文献]
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[收稿日期]2019-08-19
本文引用格式：李嘉欣，陈伟华.脂肪来源干细胞在改善老化皮肤质地中的作用及其临床应用[J].中国美容医学，2020，29（5）：187-189.