目的:建立一种基于荧光法测定重组蛋白药物中微量游离巯基的检测方法。方法:采用基于荧光法巯基检测试剂盒进行游离巯基检测，首先对蛋白变性条件进行摸索优化，确定了变性剂种类及变性条件，并采用重组蛋白药物进行了方法验证，结果均符合验证标准。但在采用该方法对我公司PEG-GCSF和KGF产品（分子序列中理论均含有1 mol巯基/mol蛋白）进行检测时，发现游离巯基检测值均显著低于理论值，检测值最高仅为理论值的29%,可能与蛋白分子内部包埋的游离巯基未充分暴露有关。因此，本研究在已有分析方法的基础上采用蛋白酶酶解的方式，充分暴露蛋白分子中的游离巯基，并对样品的酶切条件及其他关键参数进行了优化，对优化后的分析方法进行了方法学验证。结果:通过筛选，确定了最佳变性条件：终浓度为8 mol·L-1尿素37℃孵育30 min。针对已知理论游离巯基含量的重组蛋白1（PEG-GCSF）和重组蛋白2（KGF）产品游离巯基检测值明显低于理论值的问题，采用蛋白酶切方式，酶切条件为蛋白酶K酶切(目的蛋白：蛋白酶K（20∶1,w:w）,37℃孵育1 hr,酶解后检测巯基实测值与理论值一致。经验证该方法实测结果RSD均＜15%;各浓度的加标回收率均在80%～120%范围内；在1～15μmol·L-1游离巯基范围内线性良好-1定量限（LOQ）为1μmol·L-1,各项验证指标均符合验证标准，满足检测需求。结论:本研究采用蛋白酶酶切的方式进行样品前处理，充分暴露重组蛋白药物分子内包埋的游离巯基，解决了复杂重组蛋白药物产品中游离巯基无法准确定量的难题，为该类蛋白分子中微量游离巯基的定量测定和表征研究提供了方法和参考。