【摘 要】
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目的:研究人的蛋白激酶A调节亚基RⅡβ(PKARⅡβ)基因的绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体融合蛋白在胃癌细胞BGC-823内的表达和定位,初步探讨其在肿瘤细胞中的分子作用机制.方
【机 构】
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中国医科大学基础医学院细胞生物学教研室卫生部细胞生物学重点实验室,辽宁省,沈阳市,110001
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目的:研究人的蛋白激酶A调节亚基RⅡβ(PKARⅡβ)基因的绿色荧光蛋白(GFP)真核表达载体融合蛋白在胃癌细胞BGC-823内的表达和定位,初步探讨其在肿瘤细胞中的分子作用机制.方法:以pRSETB-PKARⅡβ质粒为模板,PCR扩增出全长PKARⅡβ编码序列,用Xho Ⅰ和EcoR Ⅰ双酶切后,亚克隆至含有GFP标签的融合表达栽体pEGFP-C1中.测序正确后,将重组质粒转染到胃癌细胞BGC-823中,提取细胞蛋白进行Western bolt检测.利用共聚焦激光扫描显微镜观察pEGFP-PKARⅡβ在人胃癌细胞BGC-823内的定位.结果:将人全长PKARⅡβ编码序列克隆到了真核表达载体pEGFP-C1中,酶切鉴定片段为1.2 kb,在预期的位置产生条带.Western blot检测到了融合蛋白正确表达,分子量约为72 000 Da.并观察到GFP-PKARⅡβ在HEK293和BGC-823细胞内都有表达,且定位以细胞质为主,在细胞核内少量表达.结论:成功构建了人全长PKARⅡβ编码序列的pEGFP-PKARⅡβ真核表达载体,证实GFP-PKARⅡβ蛋白在BGC-823细胞质内特异表达,为进一步研究PKARⅡβ的在胃癌中的功能提供了重要的实验材料.
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