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摘 要：为分析编码磷脂酰肌醇转移蛋白基因Os08PTS在水稻种子发育中的功能及利用Os08PTS启动子进行遗传改良。依据TDNA插入位点信息，克隆Os08PTS基因启动子，并利用生物信息学手段分析Os08PTS启动子的顺式作用元件特征，同时构建启动子与GUS融合表达载体，通过农杆菌介导法获得转基因植株，验证启动子的表达特征。结果表明：Os08PTS基因启动子片段中包含启动子的基本元件TATAbox和CAATbox，以及光调控元件、赤霉素应答元件、生长素反应元件、参与防御和应激反应相关元件等多个与生长发育或者逆境胁迫相关的顺式作用元件，还含有与分生组织表达以及胚乳表达相关元件等。进一步构建Os08PTS启动子的GUS融合载体，并获得水稻遗传转化植株。Os08PTS启动子序列能够驱动Os08PTS基因在水稻茎和种子胚的表达，该启动子具有驱动下游基因转录的活性。
关键词：水稻;启动子;GUS染色
中图分类号：S 511 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2021）03-0006-05
水稻是世界上重要的粮食作物之一，水稻胚的发育直接影响着整个植物体的繁殖和发育，因此备受研究者的关注。在分子水平上，水稻胚的发育是众多基因在外界环境因子作用下有序表达的结果。启动子作为一种重要顺式作用调控元件，在转录水平上的基因表达调控中起着重要作用。根据启动子驱动下游基因表达的特点，可分为组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子三类[1]，其中胚特异性启动子具有显著的组织特异性，可以调控内外源基因在植物胚中特异性表达。因此，分离和鉴别水稻胚特异性启动子不仅有助于了解相关功能基因在胚中的作用，而且利用胚特异性表达启动子可以使外源目的基因在胚中高效表达，同时避免因外源基因在植物其他部位的过度表达而产生对水稻农艺性状的不良影响。
启动子捕获是一种产生大规模随机插入突变体库的有力手段，广泛应用在细菌、酵母、动物和植物中[2-4]。该方法利用无启动子驱动的报告基因随机插入染色体中，通过检测报告基因在生物体中的表达与否及表达部位，可以判断报告基因插入位置附近是否有基因的启动子存在及其下游基因的表达特性，进而通过报告基因插入位置可以分离出相应的启动子及其基因。本课题组前期利用本实验室构建的水稻启动子捕获突变体库，获得1个GUS报告基因在水稻胚中特异表达的突变体W8292，TailPCR分析显示，该突变体的TDNA插入于1个编码磷脂酰肌醇转移蛋白（PITP）的基因内，命名该基因为Os08PTS。
本研究利用TDNA插入位点信息，克隆Os08PTS基因启动子，并利用生物信息学手段分析Os08PTS启动子的顺式作用元件特征，同时构建启动子与GUS融合表达载体，通过农杆菌介导法获得转基因植株，验证启动子的表达特征，为进一步分析编码磷脂酰肌醇转移蛋白基因Os08PTS在水稻种子发育中的功能及利用Os08PTS启动子进行遗传改良奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试启动子克隆材料和供试转基因水稻受体材料均为明恢86。所有材料种植在福州寿山基地内。
1.2 主要试剂
Phanta Max SuperFidelity DNA Polymerase高保真酶（诺唯赞公司），限制性内切酶、DNA Ligation Kit（TaKaRa公司）、Golden Easy PCR System、质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒（天根生化科技有限公司），引物合成、DNA 测序（福州尚亚生物技术有限公司），组织培养试剂（Sigma公司），GUS染色液（北京索莱宝科技有限公司）。
1.3 载体和菌株
供试菌株为大肠杆菌DH5α和农杆菌菌株EHA105，均购于北京博迈德生物有限公司;启动子载体pCXGUSP为福建省农业遗传工程重点实验室保存。
1.4 Os08PTS启动子的克隆和生物信息学分析
前期获得了水稻TDNA插入的基因Os08PTS在NCBI上的序列登录信息（AP014964.1），根据Os08PTS基因上游2000 bp的启动子区域，对照日本晴基因组序列设计Os08PTS启动子PCR扩增引物，引物编号及序列为P8292F1：5′gcaggagcccagaaacagca 3′
，P8292R1：5′ctaggttccccgtcttacaggct 3′。通过高保真酶PCR扩增Os08PTS启动子序列。反应程序为：95℃ 30 s;95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 2 min，32个循环;72℃，10 min。PCR产物在1.0%琼脂糖胶进行电泳回收，产物预期大小为2000 bp。把条带清晰、大小正确的PCR产物送至福州尚亚生物技术有限公司进行测序。
将测序正确的Os08PTS启动子序列，通过Plant CARE在线分析软件进行预测，进一步对Os08PTS启动子的序列进行生物信息学分析，显示出该序列的启动子序列特征。
1.5 启动子与GUS融合表达的载体构建
将测序正确的Os08PTS启动子的回收产物加尾后，与pCXGUSP质粒片段（Xcm I酶切回收）克隆，重组启动子载体名称为PCXGUSOsP08PTS。用Bam HI单酶、Sca Ⅰ单酶、Hind Ⅲ单酶对重组启动子载体进行酶切鉴定。挑选酶切条带符合预期大小的正确单克隆，摇菌送福州尚亚生物技术有限公司完成测序。测序验证后获得正确的Os08PTS
启动子载体电激转化农杆菌EHA105，于-80℃下保存备用。
1.6 水稻遗传转化
以明恢86的幼胚，經诱导后产生的愈伤组织作为转化受体，水稻愈伤组织的诱导、继代及与农杆菌的共培养，抗性愈伤组织的筛选、分化及生根等相关的培养基和具体的试验步骤参照本实验室操作方法进行 [5]。
1.7 转基因植株的PCR检测
采用CTAB法提取水稻幼嫩叶片的DNA[6]。以提取的DNA为模板，设计潮霉素标记基因的PCR引物，引物编号及序列为hyg1：TACACAGCCATCGGTCCAGA和
hyg2：TAGGAGGGCGTGGATATGTC，进行PCR扩增。PCR扩增程序：94℃ 3 min;94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃1 min，35个循环;72℃，10 min。PCR产物大小为845 bp。
1.8 转基因植株的GUS组织化学染色
将转基因水稻苗和野生型水稻苗的根、茎、叶、颖壳、花药、种子各组织取下，置于2 mL离心管中，加入配制好的GUS染色液，37℃孵育24 h。取出材料，转入75%酒精中脱色2～3次，以便彻底清除叶绿素。样本保存于75%酒精中，肉眼或者显微镜下观察染色结果。
2 结果与分析
2.1 Os08PTS启动子的克隆和生物信息学分析
根据Os08PTS基因上游2000 bp的启动子序列，通过PCR扩增得到1条长2000 bp的片段（图1）。测序结果表明，该序列长度为2000 bp，与Genbank中预测的序列一致。进一步分析Os08PTS启动子的顺式作用元件，结果如表1所示，除了含有核心元件TATAbox和CAATbox外，该片段还含有与脱落酸相关元件ABRE，茉莉酸甲酯相关元件CGTCAmotif、TGACGmotif，赤霉素相关元件Pbox，光响应相关元件AEbox、Box4、Gbox、GATAmotif、Ibox、Lbox，参与防御和应激反应相关元件TCrich repeats，生长素反应元件TGAelement，与分生组织表达相关元件CATbox，胚乳表达相关元件GCN4_motif等。這些顺式作用元件的存在，说明Os08PTS基因可能受光和多种激素的调控，还可能参与种子生长发育的调控。
2.2 启动子载体构建及农杆菌转化
将扩增得到一条长2000 bp的Os08PTS基因上游启动子片段，加尾回收，通过TA克隆，连接到克隆载体PCXGUSP质粒片段（Xcm I酶切回收）中。为了验证目的片段是否成功连接至载体上，对重组载体进行单酶切检测。根据PCXGUSP载体上的多克隆位点，同时结合Os08PTS启动子序列上的酶切位点，选用Bam HI酶、Sca Ⅰ酶、Hind Ⅲ酶分别对重组载体进行单酶切鉴定，出现条带大小分别为2000、1609和1115 bp的目的条带，结果如图2所示，这充分表明Os08PTS基因启动子已经成功连接至PCXGUSP载体上。然后将酶切鉴定正确的重组载体送至尚亚公司测序，获得含正确序列的目标片段的重组启动子载体PCXGUSOsP08PTS（图3）。采用电击法将测序结果正确的重组启动子载体转入农杆菌EHA105，通过农杆菌介导法转化水稻胚性愈伤组织，获得了转化再生植株28个克隆。
2.3 转基因植株的PCR检测
将分别提取的28个克隆水稻转化植株的基因组DNA作为模版，用PCR扩增潮霉素基因，PCR检测结果如图4所示。从部分转基因植株中扩增出目的条带，说明目的序列已经整合到水稻基因组中。在28个克隆的水稻转基因苗中，发现能扩增出目标片段大小的DNA条带有27个克隆，而野生型水稻则不能扩增出目的基因大小的条带，转化阳性率为96.4%。
2.4 转基因植株的GUS组织化学染色
从27个阳性克隆水稻转基因植株中随机选取8个克隆进行GUS组织化学染色，结果发现，所有检测的阳性转基因植株的胚均能被GUS染色液染成蓝色，而根、叶、颖壳、花药和胚乳等其他组织器官均检测不到蓝色，这与启动子捕获系突变体W8292的GUS表达特征类似，另外发现转基因植株的茎也能呈现出蓝色，而启动子捕获系突变体W8292的茎没有检测到GUS活性（图5），以上结果表明Os08PTS
上游2000 bp的启动子区能驱动下游基因在胚表达中表达，同时还具有在茎中表达的特征。
3 结论与讨论
磷脂酰肌醇转移蛋白（PITP）是指负责内膜系统间磷脂运输的蛋白，普遍存在于多细胞动物、真菌及高等植物中[7-9]。 研究表明，PITP在质膜的运输和信号转导途径中具有重要的作用，参与哺乳动物细胞分泌囊泡的形成、运输、磷脂酶C调节的信号传导，调节酵母胞质内膜组分运输和脂类的代谢，以及参与高等植物发育过程的信号传导[10-12]，但目前对其功能的分子机制仍不是很清楚。Os08PTS基因是一个在水稻胚中特异性表达PITP基因，本研究对其上游2000 bp的启动子区的生物信息学分析，发现含有脱落酸、茉莉酸、赤霉素和生长素等相关的顺式作用调控元件，表明Os08PTS基因在水稻胚中的表达可能受多种激素的调控，该结果为进一步研究Os08PTS基因在水稻胚中的调控作用提供了研究方向。
与组成型启动子相比，组织特异型启动子能减少外源基因表达产物的过度积累，不仅降低植物能量的浪费而且对转基因植株正常生长的影响较小，因此在植物转基因工程研究中具有广泛的应用前景。本研究对
Os08PTS基因上游2000 bp的启动区与GUS融合转基因植株的表达分析发现该启动子在茎和胚中特异表达，该结果与前期启动子捕获突变体W8292中GUS的胚特异性表达不太一致。前人研究也有发现类似的现象[13]，除了启动子长度外，远端的增强子、沉默子和绝缘子及基因本身的3′非翻译区对基因表达特性均会产生影响[14]，具体原因需要进一步验证。
参考文献：
[1]李田，孙景宽，刘京涛.植物启动子研究进展[J].生物技术通报，2015，31（2）：18-25. [2]ALONSO J M，STEPANOVA A N，LEISSE T J，et al.nomeWide Insertional Mutagenesis of Arabidopsis thaliana[J].Science，2003，301：653-658.
[3]RISHNAN A，GUIDERDONI E，AN G，et al.Mutant resources in rice for functional genomics of the grasses[J].Plant Physiol，2009，149：165-170.
[4]SPRINGER PS.Gene traps：tool for plant development and genomics[J].Plant Cell，2000，12：1007-1020.
[5]苏军，胡昌泉，翟红利，等.农杆菌介导籼稻明恢86高效稳定转化体系的建立[J].福建农业学报，2003，18（4）：209-213.
[6]MURRAYM G，THOMPSON W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucleic Acids Research，1980，8（19）：4321-4326.
[7]COCKCROFT S.Mammalian phosphatidylinnositiol transfer proteins：emerging roles in signal transduction and vesicle traffic[J].Chemistry and Physics of lipids，1999 ，98：23-33.
[8]LEV S.The role of the Nir/rdgB protein family in membrane trafficking and cytoskeleton remodeling[J].Exp Cell Res，2004，297（1）：1-10.
[9]PETERMAN T K，OHOL Y M，MCREYNOLDS L J，et al.Patellin1，a novel Sec14like protein，localizes to the cell plate and binds phosphoinositides[J].Plant Physiol，2004，136（2）：3080-3094.[10]COCKCROFT S.Identification of Candidate Genes for Sjogren′s Syndrome using MRL/Ipr Mouse Model of Sjogren′s Syndrome and cDNA Microarray Analysis[J].Bio Essays，1998，20：423-432.
[11]HSUAN J，COCKCROFT S G.Proteincoupled Receptor Signalling and Crosstalk Achieving Rapidity and Specificity[J].Genome Biol，2001，2：3011.
[12]COCKCROFT S.In Biology of Phosphoino sitides[J].Semin Cell Dev Biol，2001，12：183-191.
[13]顏彦，林拥军.水稻组织特异表达启动子的克隆及功能分析[D].武汉：华中农业大学，2013.
[14]PORTO M S，PINHEIRO M P N，BATISTA V G L，et al.Plant promoters： an approach of structure and function[J].Molecular Biotechnology，2014，56（1）：38-49.
（责任编辑：柯文辉）
关键词：水稻;启动子;GUS染色
中图分类号：S 511 文献标志码：A 文章编号：0253-2301（2021）03-0006-05
水稻是世界上重要的粮食作物之一，水稻胚的发育直接影响着整个植物体的繁殖和发育，因此备受研究者的关注。在分子水平上，水稻胚的发育是众多基因在外界环境因子作用下有序表达的结果。启动子作为一种重要顺式作用调控元件，在转录水平上的基因表达调控中起着重要作用。根据启动子驱动下游基因表达的特点，可分为组成型启动子、诱导型启动子和组织特异性启动子三类[1]，其中胚特异性启动子具有显著的组织特异性，可以调控内外源基因在植物胚中特异性表达。因此，分离和鉴别水稻胚特异性启动子不仅有助于了解相关功能基因在胚中的作用，而且利用胚特异性表达启动子可以使外源目的基因在胚中高效表达，同时避免因外源基因在植物其他部位的过度表达而产生对水稻农艺性状的不良影响。
启动子捕获是一种产生大规模随机插入突变体库的有力手段，广泛应用在细菌、酵母、动物和植物中[2-4]。该方法利用无启动子驱动的报告基因随机插入染色体中，通过检测报告基因在生物体中的表达与否及表达部位，可以判断报告基因插入位置附近是否有基因的启动子存在及其下游基因的表达特性，进而通过报告基因插入位置可以分离出相应的启动子及其基因。本课题组前期利用本实验室构建的水稻启动子捕获突变体库，获得1个GUS报告基因在水稻胚中特异表达的突变体W8292，TailPCR分析显示，该突变体的TDNA插入于1个编码磷脂酰肌醇转移蛋白（PITP）的基因内，命名该基因为Os08PTS。
本研究利用TDNA插入位点信息，克隆Os08PTS基因启动子，并利用生物信息学手段分析Os08PTS启动子的顺式作用元件特征，同时构建启动子与GUS融合表达载体，通过农杆菌介导法获得转基因植株，验证启动子的表达特征，为进一步分析编码磷脂酰肌醇转移蛋白基因Os08PTS在水稻种子发育中的功能及利用Os08PTS启动子进行遗传改良奠定基础。
1 材料与方法
1.1 试验材料
供试启动子克隆材料和供试转基因水稻受体材料均为明恢86。所有材料种植在福州寿山基地内。
1.2 主要试剂
Phanta Max SuperFidelity DNA Polymerase高保真酶（诺唯赞公司），限制性内切酶、DNA Ligation Kit（TaKaRa公司）、Golden Easy PCR System、质粒提取试剂盒、DNA纯化试剂盒（天根生化科技有限公司），引物合成、DNA 测序（福州尚亚生物技术有限公司），组织培养试剂（Sigma公司），GUS染色液（北京索莱宝科技有限公司）。
1.3 载体和菌株
供试菌株为大肠杆菌DH5α和农杆菌菌株EHA105，均购于北京博迈德生物有限公司;启动子载体pCXGUSP为福建省农业遗传工程重点实验室保存。
1.4 Os08PTS启动子的克隆和生物信息学分析
前期获得了水稻TDNA插入的基因Os08PTS在NCBI上的序列登录信息（AP014964.1），根据Os08PTS基因上游2000 bp的启动子区域，对照日本晴基因组序列设计Os08PTS启动子PCR扩增引物，引物编号及序列为P8292F1：5′gcaggagcccagaaacagca 3′
，P8292R1：5′ctaggttccccgtcttacaggct 3′。通过高保真酶PCR扩增Os08PTS启动子序列。反应程序为：95℃ 30 s;95℃ 15 s，60℃ 15 s，72℃ 2 min，32个循环;72℃，10 min。PCR产物在1.0%琼脂糖胶进行电泳回收，产物预期大小为2000 bp。把条带清晰、大小正确的PCR产物送至福州尚亚生物技术有限公司进行测序。
将测序正确的Os08PTS启动子序列，通过Plant CARE在线分析软件进行预测，进一步对Os08PTS启动子的序列进行生物信息学分析，显示出该序列的启动子序列特征。
1.5 启动子与GUS融合表达的载体构建
将测序正确的Os08PTS启动子的回收产物加尾后，与pCXGUSP质粒片段（Xcm I酶切回收）克隆，重组启动子载体名称为PCXGUSOsP08PTS。用Bam HI单酶、Sca Ⅰ单酶、Hind Ⅲ单酶对重组启动子载体进行酶切鉴定。挑选酶切条带符合预期大小的正确单克隆，摇菌送福州尚亚生物技术有限公司完成测序。测序验证后获得正确的Os08PTS
启动子载体电激转化农杆菌EHA105，于-80℃下保存备用。
1.6 水稻遗传转化
以明恢86的幼胚，經诱导后产生的愈伤组织作为转化受体，水稻愈伤组织的诱导、继代及与农杆菌的共培养，抗性愈伤组织的筛选、分化及生根等相关的培养基和具体的试验步骤参照本实验室操作方法进行 [5]。
1.7 转基因植株的PCR检测
采用CTAB法提取水稻幼嫩叶片的DNA[6]。以提取的DNA为模板，设计潮霉素标记基因的PCR引物，引物编号及序列为hyg1：TACACAGCCATCGGTCCAGA和
hyg2：TAGGAGGGCGTGGATATGTC，进行PCR扩增。PCR扩增程序：94℃ 3 min;94℃ 45 s，59℃ 45 s，72℃1 min，35个循环;72℃，10 min。PCR产物大小为845 bp。
1.8 转基因植株的GUS组织化学染色
将转基因水稻苗和野生型水稻苗的根、茎、叶、颖壳、花药、种子各组织取下，置于2 mL离心管中，加入配制好的GUS染色液，37℃孵育24 h。取出材料，转入75%酒精中脱色2～3次，以便彻底清除叶绿素。样本保存于75%酒精中，肉眼或者显微镜下观察染色结果。
2 结果与分析
2.1 Os08PTS启动子的克隆和生物信息学分析
根据Os08PTS基因上游2000 bp的启动子序列，通过PCR扩增得到1条长2000 bp的片段（图1）。测序结果表明，该序列长度为2000 bp，与Genbank中预测的序列一致。进一步分析Os08PTS启动子的顺式作用元件，结果如表1所示，除了含有核心元件TATAbox和CAATbox外，该片段还含有与脱落酸相关元件ABRE，茉莉酸甲酯相关元件CGTCAmotif、TGACGmotif，赤霉素相关元件Pbox，光响应相关元件AEbox、Box4、Gbox、GATAmotif、Ibox、Lbox，参与防御和应激反应相关元件TCrich repeats，生长素反应元件TGAelement，与分生组织表达相关元件CATbox，胚乳表达相关元件GCN4_motif等。這些顺式作用元件的存在，说明Os08PTS基因可能受光和多种激素的调控，还可能参与种子生长发育的调控。
2.2 启动子载体构建及农杆菌转化
将扩增得到一条长2000 bp的Os08PTS基因上游启动子片段，加尾回收，通过TA克隆，连接到克隆载体PCXGUSP质粒片段（Xcm I酶切回收）中。为了验证目的片段是否成功连接至载体上，对重组载体进行单酶切检测。根据PCXGUSP载体上的多克隆位点，同时结合Os08PTS启动子序列上的酶切位点，选用Bam HI酶、Sca Ⅰ酶、Hind Ⅲ酶分别对重组载体进行单酶切鉴定，出现条带大小分别为2000、1609和1115 bp的目的条带，结果如图2所示，这充分表明Os08PTS基因启动子已经成功连接至PCXGUSP载体上。然后将酶切鉴定正确的重组载体送至尚亚公司测序，获得含正确序列的目标片段的重组启动子载体PCXGUSOsP08PTS（图3）。采用电击法将测序结果正确的重组启动子载体转入农杆菌EHA105，通过农杆菌介导法转化水稻胚性愈伤组织，获得了转化再生植株28个克隆。
2.3 转基因植株的PCR检测
将分别提取的28个克隆水稻转化植株的基因组DNA作为模版，用PCR扩增潮霉素基因，PCR检测结果如图4所示。从部分转基因植株中扩增出目的条带，说明目的序列已经整合到水稻基因组中。在28个克隆的水稻转基因苗中，发现能扩增出目标片段大小的DNA条带有27个克隆，而野生型水稻则不能扩增出目的基因大小的条带，转化阳性率为96.4%。
2.4 转基因植株的GUS组织化学染色
从27个阳性克隆水稻转基因植株中随机选取8个克隆进行GUS组织化学染色，结果发现，所有检测的阳性转基因植株的胚均能被GUS染色液染成蓝色，而根、叶、颖壳、花药和胚乳等其他组织器官均检测不到蓝色，这与启动子捕获系突变体W8292的GUS表达特征类似，另外发现转基因植株的茎也能呈现出蓝色，而启动子捕获系突变体W8292的茎没有检测到GUS活性（图5），以上结果表明Os08PTS
上游2000 bp的启动子区能驱动下游基因在胚表达中表达，同时还具有在茎中表达的特征。
3 结论与讨论
磷脂酰肌醇转移蛋白（PITP）是指负责内膜系统间磷脂运输的蛋白，普遍存在于多细胞动物、真菌及高等植物中[7-9]。 研究表明，PITP在质膜的运输和信号转导途径中具有重要的作用，参与哺乳动物细胞分泌囊泡的形成、运输、磷脂酶C调节的信号传导，调节酵母胞质内膜组分运输和脂类的代谢，以及参与高等植物发育过程的信号传导[10-12]，但目前对其功能的分子机制仍不是很清楚。Os08PTS基因是一个在水稻胚中特异性表达PITP基因，本研究对其上游2000 bp的启动子区的生物信息学分析，发现含有脱落酸、茉莉酸、赤霉素和生长素等相关的顺式作用调控元件，表明Os08PTS基因在水稻胚中的表达可能受多种激素的调控，该结果为进一步研究Os08PTS基因在水稻胚中的调控作用提供了研究方向。
与组成型启动子相比，组织特异型启动子能减少外源基因表达产物的过度积累，不仅降低植物能量的浪费而且对转基因植株正常生长的影响较小，因此在植物转基因工程研究中具有广泛的应用前景。本研究对
Os08PTS基因上游2000 bp的启动区与GUS融合转基因植株的表达分析发现该启动子在茎和胚中特异表达，该结果与前期启动子捕获突变体W8292中GUS的胚特异性表达不太一致。前人研究也有发现类似的现象[13]，除了启动子长度外，远端的增强子、沉默子和绝缘子及基因本身的3′非翻译区对基因表达特性均会产生影响[14]，具体原因需要进一步验证。
参考文献：
[1]李田，孙景宽，刘京涛.植物启动子研究进展[J].生物技术通报，2015，31（2）：18-25. [2]ALONSO J M，STEPANOVA A N，LEISSE T J，et al.nomeWide Insertional Mutagenesis of Arabidopsis thaliana[J].Science，2003，301：653-658.
[3]RISHNAN A，GUIDERDONI E，AN G，et al.Mutant resources in rice for functional genomics of the grasses[J].Plant Physiol，2009，149：165-170.
[4]SPRINGER PS.Gene traps：tool for plant development and genomics[J].Plant Cell，2000，12：1007-1020.
[5]苏军，胡昌泉，翟红利，等.农杆菌介导籼稻明恢86高效稳定转化体系的建立[J].福建农业学报，2003，18（4）：209-213.
[6]MURRAYM G，THOMPSON W F.Rapid isolation of high molecular weight plant DNA[J].Nucleic Acids Research，1980，8（19）：4321-4326.
[7]COCKCROFT S.Mammalian phosphatidylinnositiol transfer proteins：emerging roles in signal transduction and vesicle traffic[J].Chemistry and Physics of lipids，1999 ，98：23-33.
[8]LEV S.The role of the Nir/rdgB protein family in membrane trafficking and cytoskeleton remodeling[J].Exp Cell Res，2004，297（1）：1-10.
[9]PETERMAN T K，OHOL Y M，MCREYNOLDS L J，et al.Patellin1，a novel Sec14like protein，localizes to the cell plate and binds phosphoinositides[J].Plant Physiol，2004，136（2）：3080-3094.[10]COCKCROFT S.Identification of Candidate Genes for Sjogren′s Syndrome using MRL/Ipr Mouse Model of Sjogren′s Syndrome and cDNA Microarray Analysis[J].Bio Essays，1998，20：423-432.
[11]HSUAN J，COCKCROFT S G.Proteincoupled Receptor Signalling and Crosstalk Achieving Rapidity and Specificity[J].Genome Biol，2001，2：3011.
[12]COCKCROFT S.In Biology of Phosphoino sitides[J].Semin Cell Dev Biol，2001，12：183-191.
[13]顏彦，林拥军.水稻组织特异表达启动子的克隆及功能分析[D].武汉：华中农业大学，2013.
[14]PORTO M S，PINHEIRO M P N，BATISTA V G L，et al.Plant promoters： an approach of structure and function[J].Molecular Biotechnology，2014，56（1）：38-49.
（责任编辑：柯文辉）