【摘 要】
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目的 构建大鼠永生化神经前体细胞(INPC)CDH1小干扰RNA(siRNA)真核载体.方法 根据大鼠CDH1基因的编码序列设计3个小发夹RNA(shRNA)干扰序列及1个阴性对照序列,根据pENTR/H1/T
【机 构】
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华中科技大学同济医学院附属同济医院麻醉科, 武汉市,430030
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目的 构建大鼠永生化神经前体细胞(INPC)CDH1小干扰RNA(siRNA)真核载体.方法 根据大鼠CDH1基因的编码序列设计3个小发夹RNA(shRNA)干扰序列及1个阴性对照序列,根据pENTR/H1/TO中间载体说明书设计并合成相应的DNA单链,退火后分别连接到pENTR/H1/TO线性载体上,形成完整载体,提取CDH1 siRNA真核载体后(分别为CDH1 siRNA1、CDH1 siRNA2、CDH1siRNA3和CDH1 siRNA对照),进行DNA测序鉴定.采用Lipofectamine 2000法,分别将成功构建的CDH1siRNA真核载体转染大鼠INPC,于转染24 h和48 h时计算INPC转染效率=INPC成功转染数/细胞总数,于转染48 h时提取细胞总RNA,采用实时定量PCR法检测INPC CDH1 mRNA的表达.结果 经DNA测序鉴定构建的3个CDH1 siRNA真核载体和1个阴性对照载体所插入的RNA干扰序列均正确,无碱基突变或缺失;INPC转染24 h与48 h时转染效率分别为(54±5)%和(36±4)%;CDH1 siRNA2转染INPC 48 h时INPC CDH1 mRNA表达水平较CDH1 siRNA3降低,且两者均低于CDH1 siRNA1(P
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