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摘要:通过文献搜索,收集整理了影响猪生长和肉质性状的显著单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点,基于飞行时间质谱技术对大约克(n=400)和长白(n=399)样本进行SNP快速分型,并分析了这些位点在大约克和长白群体内的基因型、等位基因频率、哈代-温伯格平衡状态等遗传学特征。结果表明:利用飞行时间质谱技术可对17个影响猪肉质和生长性状的显著SNP位点进行同时快速基因分型,平均个体检出率为96.35%;17个被检SNP位点中9个为多态位点,其它8个为只有一种基因型的单态位点;多态SNP位点中有6个处于哈代-温伯格平衡状态,其它3个严重偏离哈代-温伯格平衡。本研究收集了对猪生长和肉质性状具有显著效应的SNP位点,探讨了利用飞行质谱技术进行多位点SNP快速分型的可行性,为今后建立猪生长和肉质性状标记辅助选择、加快猪的遗传研究进展奠定基础。
关键词:猪;飞行时间质谱技术;单核苷酸多态性(SNP);等位基因频率;标记辅助选择
中图分类号:S828.2文献标识号:A文章编号:1001-4942(2016)08-0128-06
AbstractIn the study, we collected the single nucleotide polymorphism (SNP) loci related with growth and meat quality of pigs by searching published papers and public databases. Based on the time-of-flight mass spectrometry (TOF-MS) technique, we genotyped the samples of Yorkshire (n=400) and Landrace (n=399), and analyzed the genotype frequency, allele frequency, and Hardy-Weinberg Equilibrium testing of these SNPs. The results showed that using TOF-MS, we successfully genotyped 17 SNPs at the same time, and the average call rate of these SNPs was 96.35%. Nine of the 17 SNPs were polymorphic loci, and the other 8 were monomorphic loci, which had only one genotype in both Yorkshire and Landrace. Additionally, for the 9 polymorphic SNPs, 6 SNPs were in the Hardy-Weinberg Equilibrium and the other 3 deviated from it significantly. This study collected the significant SNPs related with growth and meat quality, and verified the effectiveness of genotyping multiple SNPs simultaneously and rapidly using TOF-MS, which provided foundations for the marker assisted selection (MAS) and the improvement of genetic progress of pigs.
KeywordsPig; Time-of-flight mass spectrometry (TOF-MS); Single nucleotide polymorphism (SNP); Allele frequency; Marker assisted selection (MAS)
近年来,随着分子遗传学的发展,遗传标记逐渐用于畜禽的标记辅助选择(marker assisted selection,MAS)育种中,以提高遗传选育的准确性。但是,对于数量性状,应用单个或者少数基因的MAS只能够解释很小比例的遗传变异,因此限制了标记辅助选择在畜禽育种中的应用。近年来发展起来的基于高密度SNP芯片的基因组选择技术克服了传统MAS的缺陷,但是其成本相对较高,对奶牛育种来说是可以承受的,对猪、鸡和羊等畜禽来说太高,在一定程度上影响了基因组选择在猪、鸡和羊等畜禽中的应用。
Zhang等[1]通过模拟研究表明,使用高密度芯片总标记数5%的标记即可获得高密度芯片95%的准确性,而且使用性状筛选标记效果要好于均匀分布的标记。随着分子遗传学的发展,广大科研工作者对影响猪繁殖、肉质和抗病等常规选育受到限制的性状基因进行了广泛的研究。通过候选基因、数量性状基因座(QTL)定位和全基因组关联分析等策略已经发现了数十个影响猪繁殖、肉质和抗病等性状的主效基因、QTL和DNA标记。本研究通过文献搜索,收集整理了对猪生长和肉质性状具有显著效应的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点,探讨利用飞行质谱技术进行多位点SNP快速分型的可行性,为今后建立猪生长和肉质性状标记辅助选择、加快猪的遗传研究进展奠定基础。
1材料与方法
1.1试验动物和样本采集
研究所测样品均来自山东省菏泽宏兴原种猪繁育有限公司,包括大约克(Yorkshire, n=400)和长白(Landrace, n=399)共799头仔猪。仔猪达35日龄时,每窝随机选取3~5头生长发育良好的健康仔猪,取耳组织,加入70%乙醇,-20℃保存备用。酚-氯仿法提取基因组DNA。利用1.5%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop进行DNA质量和浓度分析, -20℃储存备用。 1.2具有显著效应的猪生长和肉质性状SNP搜集
通过PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)、中国知网(http://www.cnki.net/)和dpSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/index.html)等公共生物信息数据资源进行文献搜索和SNP信息收集,并通过不同来源信息的重复验证和筛选,获得对猪生长和肉质性状具有显著效应的SNP标记。
1.3SNP分型检测
基于Sequenom公司的MassArray iPLEX飞行时间质谱基因分型平台进行SNP分型检测。Sequenom MassArray SNP检测具体原理是先根据位点信息设计特异性PCR引物和延伸引物(具体引物信息如表2所示),将包含SNP位点区域的DNA模板通过PCR技术扩增,扩增产物以SAP酶去除多余dNTPs,然后对待检位点同时进行单碱基延伸,位点特异性延伸引物在突变位点处延伸一个碱基并终止,因此其可根据突变类型的差异而连接上不同的ddNTPs,形成分子量差异。延伸产物经过树脂纯化后,点样至靶片上,使用质谱仪对不同延伸产物的分子量进行检测,通过专用的分析软件MassArray Typer 4.0 进行处理,就可得到各突变位点的具体基因型。
1.4数据整理和统计分析
利用Excel 整理原始数据。利用皮尔逊卡方统计量对各SNP位点进行哈代-温伯格平衡检验,并利用Excel中的CHIDIST函数计算卡方值相应的P值。
皮尔逊卡方统计量定义为χ2=∑(O-E)2E,该式是对某一给定位点所有基因型的求和。式中O(Observed)代表每个基因型的观测数目,E(Expected)代表每个基因型在哈代-温伯格平衡定律成立的假定下的期望数目。
2结果与分析
2.1样本基因组DNA提取及检测
使用经典的酚-氯仿法提取猪耳组织样本中的基因组DNA。通过琼脂糖凝胶电泳检测,胶图显示DNA条带单一、清晰、无杂质,没有弥散、拖尾现象,说明DNA完整度好。通过Nanodrop紫外分光光度计法检测DNA的纯度和浓度,调整DNA终浓度在100 ng/μL左右,-20℃储存备用。
2.2影响猪生长和肉质性状的显著SNP搜集
通过对公共生物信息数据资源进行文献搜索,本研究共收集整理了24个SNP位点,其中14个SNP来自10个候选基因,包括氟烷基因(Hal,1个SNP)、酸肉基因(RN,2个SNP)、脂肪细胞决定和分化因子1基因(ADD1,1个SNP)、乙酰辅酶A羧化酶α基因(ACACA,1个SNP)、肌肉生长抑制素基因(MSTN,3个SNP)、胰岛素样生长因子2基因(IGF2,1个SNP)、黑素皮质素受体4基因(MC4R,1个SNP)、Leptin受体基因(LEPR,1个 SNP)、肌细胞生成素Myogenin 基因(MyoG,1个 SNP)、脂肪肥胖相关基因(FTO,2个SNP);10个SNP来自3篇肉质相关的全基因组关联分析文章。24个SNP位点的具体信息详见表1所示。
根据位点信息设计特异性PCR引物和延伸引物时,有4个SNP位点与其它位点的引物发生冲突,包括RN的1个 SNP、MSTN的1个 SNP、IGF2的1个 SNP和 G5位点,没有包含在检测范围内。20个SNP位点在基因分型中所使用的引物信息详见表2所示。
2.3大约克和长白群体SNP分型结果
对本研究中大约克(n=400)和长白(n=399)共799个样本基因组DNA基于Sequenom公司的MassArray iPLEX飞行时间质谱基因分型平台进行SNP基因分型,20个检测位点中有3个分型失败(G3、LEPR和MSTN3),其余17个SNP位点均能够很好地检测出常见的三种基因型。17个SNP位点的平均个体检出率为96.35%,其中最高检出率为99.01%,最低检出率为 89.51%,各SNP位点具体检测结果详见表3所示。
17个成功检测的SNP位点中有8个(Hal、ADD1、FTO1、G9、G10、MSTN1、MyoG、RN2)为单态位点,即这些SNP位点在被检的大约克和长白样品中只有一种基因型,其余9个SNP位点(ACACA、MC4R、FTO2、G1、G2、G4、G6、G7、G8)在两个品种内均存在多态。利用皮尔逊卡方统计量对9个具有多态的SNP位点进行哈代-温伯格平衡检验,结果表明6个SNP位点处于哈代-温伯格平衡状态,其它3个SNP位点(G1、G2和G4)严重偏离哈代-温伯格平衡。
3讨论与结论
单核苷酸多态性(SNP)是基因组上广泛分布并能稳定遗传的DNA序列多态性。随着分子生物学技术的迅猛发展,产生了一系列能够实现大规模高通量的基因分型方法,如高通量测序技术、芯片技术和飞行时间质谱技术等。飞行时间质谱技术在SNP分型中表现出的高通量、准确性高、灵敏度高三大特点,及其较高的性价比,已成为众多科研人员进行SNP基因分型研究的首选[15,16]。本研究利用飞行时间质谱技术检测了大约克和长白群体799个样本的17个SNP位点,其检出率平均达96.35%,说明飞行时间质谱技术可实现位点和样本的高通量和自动化SNP分型。但应该指出的是,飞行时间质谱法是利用多重PCR反应的原理实现对多个SNP位点的同时检测,过多的引物在一个反应体系中容易形成引物二聚体,增加引物设计的难度。飞行时间质谱技术的这种局限性,有时会导致某些选定的SNP位点不能包括在同一个反应体系中。例如本研究中,预筛选时选择了24个SNP位点,但在设计特异性PCR引物和延伸引物时,4个位点(包括RN的1个SNP、MSTN的1个SNP、IGF2的1个SNP和G5位点)与其它位点的引物发生冲突,不能包含在检测范围内。 在通过文献和公共数据库进行显著效应SNP信息收集过程中,有些候选基因,如心脏脂肪酸结合蛋白基因[17]、钙蛋白酶抑制蛋白基因[18]和二酰基甘油酰基转移酶基因[19]等,利用的是基于PCR-RFLP方法进行的SNP基因分型,文献中没有具体的序列信息,不好确定SNP在基因组中的具体位置。我们曾经尝试用文献中提供的引物进行PCR测序,但结果不理想。另外,有些基因报道较多,但是不同研究者报道的基因效应不一致,故有几个常见猪生长和肉质相关基因排除在本研究之外。本研究中还有部分SNP来自于全基因组关联分析文章。全基因组关联分析是近几年发展起来的鉴定影响目标性状显著SNP的一种方法。但是目前,肉质性状的全基因组关联分析文章不多,而且有些文章[20,21]只给出了某个SNP位点的P值,没有指明SNP两个等位基因的效应,这样的文章对我们在SNP收集中参考意义也不大。
本研究中,17个成功检测的SNP位点中有8个为单态位点,这8个SNP位点均具有较大的效应。大约克和长白均是高度选育的商业化猪种,在长期的选择过程中,使这些发现较早且效应较大的SNP位点逐渐纯合。最显著的例子是氟烷基因(Hal)[2],氟烷基因能够促进猪的肌肉生长,但是容易引起猪应激综合征。自从20世纪90年代发现氟烷基因编码蛋白的一个氨基酸突变(由精氨酸变成半肤氨酸)是导致猪应激综合征的原因以来,各育种公司利用MAS方法从群体中逐渐剔除了Hal的有害等位基因。另外9个多态SNP位点中,有3个SNP位点(G1、G2和G4)严重偏离哈代-温伯格平衡,说明这3个位点已经受到了高度选择。对于其它6个处于哈代-温伯格平衡状态的多态SNP位点,我们认为可能有两种原因,一是这些SNP是影响猪生长和肉质形状的显著SNP,但是效应较小;二是这些SNP具有多效性,使其在选育中受到的选育程度较轻。
总之,本研究利用飞行时间质谱技术成功检测了影响猪生长和肉质性状的17个SNP位点,建立了一套高通量、快速、准确的SNP检测平台,为今后建立猪生长和肉质性状遗传标记的开发和利用、加快猪的遗传研究进展奠定基础。
参考文献:
[1]
Zhang Z, Ding X, Liu J, et al. Accuracy of genomic prediction using low-density marker panels [J]. Journal of Dairy Science, 2011, 94(7): 3642-3650.
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关键词:猪;飞行时间质谱技术;单核苷酸多态性(SNP);等位基因频率;标记辅助选择
中图分类号:S828.2文献标识号:A文章编号:1001-4942(2016)08-0128-06
AbstractIn the study, we collected the single nucleotide polymorphism (SNP) loci related with growth and meat quality of pigs by searching published papers and public databases. Based on the time-of-flight mass spectrometry (TOF-MS) technique, we genotyped the samples of Yorkshire (n=400) and Landrace (n=399), and analyzed the genotype frequency, allele frequency, and Hardy-Weinberg Equilibrium testing of these SNPs. The results showed that using TOF-MS, we successfully genotyped 17 SNPs at the same time, and the average call rate of these SNPs was 96.35%. Nine of the 17 SNPs were polymorphic loci, and the other 8 were monomorphic loci, which had only one genotype in both Yorkshire and Landrace. Additionally, for the 9 polymorphic SNPs, 6 SNPs were in the Hardy-Weinberg Equilibrium and the other 3 deviated from it significantly. This study collected the significant SNPs related with growth and meat quality, and verified the effectiveness of genotyping multiple SNPs simultaneously and rapidly using TOF-MS, which provided foundations for the marker assisted selection (MAS) and the improvement of genetic progress of pigs.
KeywordsPig; Time-of-flight mass spectrometry (TOF-MS); Single nucleotide polymorphism (SNP); Allele frequency; Marker assisted selection (MAS)
近年来,随着分子遗传学的发展,遗传标记逐渐用于畜禽的标记辅助选择(marker assisted selection,MAS)育种中,以提高遗传选育的准确性。但是,对于数量性状,应用单个或者少数基因的MAS只能够解释很小比例的遗传变异,因此限制了标记辅助选择在畜禽育种中的应用。近年来发展起来的基于高密度SNP芯片的基因组选择技术克服了传统MAS的缺陷,但是其成本相对较高,对奶牛育种来说是可以承受的,对猪、鸡和羊等畜禽来说太高,在一定程度上影响了基因组选择在猪、鸡和羊等畜禽中的应用。
Zhang等[1]通过模拟研究表明,使用高密度芯片总标记数5%的标记即可获得高密度芯片95%的准确性,而且使用性状筛选标记效果要好于均匀分布的标记。随着分子遗传学的发展,广大科研工作者对影响猪繁殖、肉质和抗病等常规选育受到限制的性状基因进行了广泛的研究。通过候选基因、数量性状基因座(QTL)定位和全基因组关联分析等策略已经发现了数十个影响猪繁殖、肉质和抗病等性状的主效基因、QTL和DNA标记。本研究通过文献搜索,收集整理了对猪生长和肉质性状具有显著效应的单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism, SNP)位点,探讨利用飞行质谱技术进行多位点SNP快速分型的可行性,为今后建立猪生长和肉质性状标记辅助选择、加快猪的遗传研究进展奠定基础。
1材料与方法
1.1试验动物和样本采集
研究所测样品均来自山东省菏泽宏兴原种猪繁育有限公司,包括大约克(Yorkshire, n=400)和长白(Landrace, n=399)共799头仔猪。仔猪达35日龄时,每窝随机选取3~5头生长发育良好的健康仔猪,取耳组织,加入70%乙醇,-20℃保存备用。酚-氯仿法提取基因组DNA。利用1.5%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop进行DNA质量和浓度分析, -20℃储存备用。 1.2具有显著效应的猪生长和肉质性状SNP搜集
通过PubMed(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed)、中国知网(http://www.cnki.net/)和dpSNP(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/index.html)等公共生物信息数据资源进行文献搜索和SNP信息收集,并通过不同来源信息的重复验证和筛选,获得对猪生长和肉质性状具有显著效应的SNP标记。
1.3SNP分型检测
基于Sequenom公司的MassArray iPLEX飞行时间质谱基因分型平台进行SNP分型检测。Sequenom MassArray SNP检测具体原理是先根据位点信息设计特异性PCR引物和延伸引物(具体引物信息如表2所示),将包含SNP位点区域的DNA模板通过PCR技术扩增,扩增产物以SAP酶去除多余dNTPs,然后对待检位点同时进行单碱基延伸,位点特异性延伸引物在突变位点处延伸一个碱基并终止,因此其可根据突变类型的差异而连接上不同的ddNTPs,形成分子量差异。延伸产物经过树脂纯化后,点样至靶片上,使用质谱仪对不同延伸产物的分子量进行检测,通过专用的分析软件MassArray Typer 4.0 进行处理,就可得到各突变位点的具体基因型。
1.4数据整理和统计分析
利用Excel 整理原始数据。利用皮尔逊卡方统计量对各SNP位点进行哈代-温伯格平衡检验,并利用Excel中的CHIDIST函数计算卡方值相应的P值。
皮尔逊卡方统计量定义为χ2=∑(O-E)2E,该式是对某一给定位点所有基因型的求和。式中O(Observed)代表每个基因型的观测数目,E(Expected)代表每个基因型在哈代-温伯格平衡定律成立的假定下的期望数目。
2结果与分析
2.1样本基因组DNA提取及检测
使用经典的酚-氯仿法提取猪耳组织样本中的基因组DNA。通过琼脂糖凝胶电泳检测,胶图显示DNA条带单一、清晰、无杂质,没有弥散、拖尾现象,说明DNA完整度好。通过Nanodrop紫外分光光度计法检测DNA的纯度和浓度,调整DNA终浓度在100 ng/μL左右,-20℃储存备用。
2.2影响猪生长和肉质性状的显著SNP搜集
通过对公共生物信息数据资源进行文献搜索,本研究共收集整理了24个SNP位点,其中14个SNP来自10个候选基因,包括氟烷基因(Hal,1个SNP)、酸肉基因(RN,2个SNP)、脂肪细胞决定和分化因子1基因(ADD1,1个SNP)、乙酰辅酶A羧化酶α基因(ACACA,1个SNP)、肌肉生长抑制素基因(MSTN,3个SNP)、胰岛素样生长因子2基因(IGF2,1个SNP)、黑素皮质素受体4基因(MC4R,1个SNP)、Leptin受体基因(LEPR,1个 SNP)、肌细胞生成素Myogenin 基因(MyoG,1个 SNP)、脂肪肥胖相关基因(FTO,2个SNP);10个SNP来自3篇肉质相关的全基因组关联分析文章。24个SNP位点的具体信息详见表1所示。
根据位点信息设计特异性PCR引物和延伸引物时,有4个SNP位点与其它位点的引物发生冲突,包括RN的1个 SNP、MSTN的1个 SNP、IGF2的1个 SNP和 G5位点,没有包含在检测范围内。20个SNP位点在基因分型中所使用的引物信息详见表2所示。
2.3大约克和长白群体SNP分型结果
对本研究中大约克(n=400)和长白(n=399)共799个样本基因组DNA基于Sequenom公司的MassArray iPLEX飞行时间质谱基因分型平台进行SNP基因分型,20个检测位点中有3个分型失败(G3、LEPR和MSTN3),其余17个SNP位点均能够很好地检测出常见的三种基因型。17个SNP位点的平均个体检出率为96.35%,其中最高检出率为99.01%,最低检出率为 89.51%,各SNP位点具体检测结果详见表3所示。
17个成功检测的SNP位点中有8个(Hal、ADD1、FTO1、G9、G10、MSTN1、MyoG、RN2)为单态位点,即这些SNP位点在被检的大约克和长白样品中只有一种基因型,其余9个SNP位点(ACACA、MC4R、FTO2、G1、G2、G4、G6、G7、G8)在两个品种内均存在多态。利用皮尔逊卡方统计量对9个具有多态的SNP位点进行哈代-温伯格平衡检验,结果表明6个SNP位点处于哈代-温伯格平衡状态,其它3个SNP位点(G1、G2和G4)严重偏离哈代-温伯格平衡。
3讨论与结论
单核苷酸多态性(SNP)是基因组上广泛分布并能稳定遗传的DNA序列多态性。随着分子生物学技术的迅猛发展,产生了一系列能够实现大规模高通量的基因分型方法,如高通量测序技术、芯片技术和飞行时间质谱技术等。飞行时间质谱技术在SNP分型中表现出的高通量、准确性高、灵敏度高三大特点,及其较高的性价比,已成为众多科研人员进行SNP基因分型研究的首选[15,16]。本研究利用飞行时间质谱技术检测了大约克和长白群体799个样本的17个SNP位点,其检出率平均达96.35%,说明飞行时间质谱技术可实现位点和样本的高通量和自动化SNP分型。但应该指出的是,飞行时间质谱法是利用多重PCR反应的原理实现对多个SNP位点的同时检测,过多的引物在一个反应体系中容易形成引物二聚体,增加引物设计的难度。飞行时间质谱技术的这种局限性,有时会导致某些选定的SNP位点不能包括在同一个反应体系中。例如本研究中,预筛选时选择了24个SNP位点,但在设计特异性PCR引物和延伸引物时,4个位点(包括RN的1个SNP、MSTN的1个SNP、IGF2的1个SNP和G5位点)与其它位点的引物发生冲突,不能包含在检测范围内。 在通过文献和公共数据库进行显著效应SNP信息收集过程中,有些候选基因,如心脏脂肪酸结合蛋白基因[17]、钙蛋白酶抑制蛋白基因[18]和二酰基甘油酰基转移酶基因[19]等,利用的是基于PCR-RFLP方法进行的SNP基因分型,文献中没有具体的序列信息,不好确定SNP在基因组中的具体位置。我们曾经尝试用文献中提供的引物进行PCR测序,但结果不理想。另外,有些基因报道较多,但是不同研究者报道的基因效应不一致,故有几个常见猪生长和肉质相关基因排除在本研究之外。本研究中还有部分SNP来自于全基因组关联分析文章。全基因组关联分析是近几年发展起来的鉴定影响目标性状显著SNP的一种方法。但是目前,肉质性状的全基因组关联分析文章不多,而且有些文章[20,21]只给出了某个SNP位点的P值,没有指明SNP两个等位基因的效应,这样的文章对我们在SNP收集中参考意义也不大。
本研究中,17个成功检测的SNP位点中有8个为单态位点,这8个SNP位点均具有较大的效应。大约克和长白均是高度选育的商业化猪种,在长期的选择过程中,使这些发现较早且效应较大的SNP位点逐渐纯合。最显著的例子是氟烷基因(Hal)[2],氟烷基因能够促进猪的肌肉生长,但是容易引起猪应激综合征。自从20世纪90年代发现氟烷基因编码蛋白的一个氨基酸突变(由精氨酸变成半肤氨酸)是导致猪应激综合征的原因以来,各育种公司利用MAS方法从群体中逐渐剔除了Hal的有害等位基因。另外9个多态SNP位点中,有3个SNP位点(G1、G2和G4)严重偏离哈代-温伯格平衡,说明这3个位点已经受到了高度选择。对于其它6个处于哈代-温伯格平衡状态的多态SNP位点,我们认为可能有两种原因,一是这些SNP是影响猪生长和肉质形状的显著SNP,但是效应较小;二是这些SNP具有多效性,使其在选育中受到的选育程度较轻。
总之,本研究利用飞行时间质谱技术成功检测了影响猪生长和肉质性状的17个SNP位点,建立了一套高通量、快速、准确的SNP检测平台,为今后建立猪生长和肉质性状遗传标记的开发和利用、加快猪的遗传研究进展奠定基础。
参考文献:
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