论文部分内容阅读
摘要：通过文献搜索，收集整理了影响猪生长和肉质性状的显著单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism， SNP）位点，基于飞行时间质谱技术对大约克（n=400）和长白（n=399）样本进行SNP快速分型，并分析了这些位点在大约克和长白群体内的基因型、等位基因频率、哈代-温伯格平衡状态等遗传学特征。结果表明：利用飞行时间质谱技术可对17个影响猪肉质和生长性状的显著SNP位点进行同时快速基因分型，平均个体检出率为96.35%；17个被检SNP位点中9个为多态位点，其它8个为只有一种基因型的单态位点；多态SNP位点中有6个处于哈代-温伯格平衡状态，其它3个严重偏离哈代-温伯格平衡。本研究收集了对猪生长和肉质性状具有显著效应的SNP位点，探讨了利用飞行质谱技术进行多位点SNP快速分型的可行性，为今后建立猪生长和肉质性状标记辅助选择、加快猪的遗传研究进展奠定基础。
关键词：猪；飞行时间质谱技术；单核苷酸多态性（SNP）；等位基因频率；标记辅助选择
中图分类号：S828.2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）08-0128-06
AbstractIn the study， we collected the single nucleotide polymorphism （SNP） loci related with growth and meat quality of pigs by searching published papers and public databases. Based on the time-of-flight mass spectrometry （TOF-MS） technique， we genotyped the samples of Yorkshire （n=400） and Landrace （n=399）， and analyzed the genotype frequency， allele frequency， and Hardy-Weinberg Equilibrium testing of these SNPs. The results showed that using TOF-MS， we successfully genotyped 17 SNPs at the same time， and the average call rate of these SNPs was 96.35%. Nine of the 17 SNPs were polymorphic loci， and the other 8 were monomorphic loci， which had only one genotype in both Yorkshire and Landrace. Additionally， for the 9 polymorphic SNPs， 6 SNPs were in the Hardy-Weinberg Equilibrium and the other 3 deviated from it significantly. This study collected the significant SNPs related with growth and meat quality， and verified the effectiveness of genotyping multiple SNPs simultaneously and rapidly using TOF-MS， which provided foundations for the marker assisted selection （MAS） and the improvement of genetic progress of pigs.
KeywordsPig； Time-of-flight mass spectrometry （TOF-MS）； Single nucleotide polymorphism （SNP）； Allele frequency； Marker assisted selection （MAS）
近年来，随着分子遗传学的发展，遗传标记逐渐用于畜禽的标记辅助选择（marker assisted selection，MAS）育种中，以提高遗传选育的准确性。但是，对于数量性状，应用单个或者少数基因的MAS只能够解释很小比例的遗传变异，因此限制了标记辅助选择在畜禽育种中的应用。近年来发展起来的基于高密度SNP芯片的基因组选择技术克服了传统MAS的缺陷，但是其成本相对较高，对奶牛育种来说是可以承受的，对猪、鸡和羊等畜禽来说太高，在一定程度上影响了基因组选择在猪、鸡和羊等畜禽中的应用。
Zhang等[1]通过模拟研究表明，使用高密度芯片总标记数5%的标记即可获得高密度芯片95%的准确性，而且使用性状筛选标记效果要好于均匀分布的标记。随着分子遗传学的发展，广大科研工作者对影响猪繁殖、肉质和抗病等常规选育受到限制的性状基因进行了广泛的研究。通过候选基因、数量性状基因座（QTL）定位和全基因组关联分析等策略已经发现了数十个影响猪繁殖、肉质和抗病等性状的主效基因、QTL和DNA标记。本研究通过文献搜索，收集整理了对猪生长和肉质性状具有显著效应的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism， SNP）位点，探讨利用飞行质谱技术进行多位点SNP快速分型的可行性，为今后建立猪生长和肉质性状标记辅助选择、加快猪的遗传研究进展奠定基础。
1材料与方法
1.1试验动物和样本采集
研究所测样品均来自山东省菏泽宏兴原种猪繁育有限公司，包括大约克（Yorkshire， n=400）和长白（Landrace， n=399）共799头仔猪。仔猪达35日龄时，每窝随机选取3～5头生长发育良好的健康仔猪，取耳组织，加入70%乙醇，-20℃保存备用。酚-氯仿法提取基因组DNA。利用1.5%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop进行DNA质量和浓度分析， -20℃储存备用。 1.2具有显著效应的猪生长和肉质性状SNP搜集
通过PubMed（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）、中国知网（http：//www.cnki.net/）和dpSNP（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/index.html）等公共生物信息数据资源进行文献搜索和SNP信息收集，并通过不同来源信息的重复验证和筛选，获得对猪生长和肉质性状具有显著效应的SNP标记。
1.3SNP分型检测
基于Sequenom公司的MassArray iPLEX飞行时间质谱基因分型平台进行SNP分型检测。Sequenom MassArray SNP检测具体原理是先根据位点信息设计特异性PCR引物和延伸引物（具体引物信息如表2所示），将包含SNP位点区域的DNA模板通过PCR技术扩增，扩增产物以SAP酶去除多余dNTPs，然后对待检位点同时进行单碱基延伸，位点特异性延伸引物在突变位点处延伸一个碱基并终止，因此其可根据突变类型的差异而连接上不同的ddNTPs，形成分子量差异。延伸产物经过树脂纯化后，点样至靶片上，使用质谱仪对不同延伸产物的分子量进行检测，通过专用的分析软件MassArray Typer 4.0 进行处理，就可得到各突变位点的具体基因型。
1.4数据整理和统计分析
利用Excel 整理原始数据。利用皮尔逊卡方统计量对各SNP位点进行哈代-温伯格平衡检验，并利用Excel中的CHIDIST函数计算卡方值相应的P值。
皮尔逊卡方统计量定义为χ2=∑（O-E）2E，该式是对某一给定位点所有基因型的求和。式中O（Observed）代表每个基因型的观测数目，E（Expected）代表每个基因型在哈代-温伯格平衡定律成立的假定下的期望数目。
2结果与分析
2.1样本基因组DNA提取及检测
使用经典的酚-氯仿法提取猪耳组织样本中的基因组DNA。通过琼脂糖凝胶电泳检测，胶图显示DNA条带单一、清晰、无杂质，没有弥散、拖尾现象，说明DNA完整度好。通过Nanodrop紫外分光光度计法检测DNA的纯度和浓度，调整DNA终浓度在100 ng/μL左右，-20℃储存备用。
2.2影响猪生长和肉质性状的显著SNP搜集
通过对公共生物信息数据资源进行文献搜索，本研究共收集整理了24个SNP位点，其中14个SNP来自10个候选基因，包括氟烷基因（Hal，1个SNP）、酸肉基因（RN，2个SNP）、脂肪细胞决定和分化因子1基因（ADD1，1个SNP）、乙酰辅酶A羧化酶α基因（ACACA，1个SNP）、肌肉生长抑制素基因（MSTN，3个SNP）、胰岛素样生长因子2基因（IGF2，1个SNP）、黑素皮质素受体4基因（MC4R，1个SNP）、Leptin受体基因（LEPR，1个 SNP）、肌细胞生成素Myogenin 基因（MyoG，1个 SNP）、脂肪肥胖相关基因（FTO，2个SNP）；10个SNP来自3篇肉质相关的全基因组关联分析文章。24个SNP位点的具体信息详见表1所示。
根据位点信息设计特异性PCR引物和延伸引物时，有4个SNP位点与其它位点的引物发生冲突，包括RN的1个 SNP、MSTN的1个 SNP、IGF2的1个 SNP和 G5位点，没有包含在检测范围内。20个SNP位点在基因分型中所使用的引物信息详见表2所示。
2.3大约克和长白群体SNP分型结果
对本研究中大约克（n=400）和长白（n=399）共799个样本基因组DNA基于Sequenom公司的MassArray iPLEX飞行时间质谱基因分型平台进行SNP基因分型，20个检测位点中有3个分型失败（G3、LEPR和MSTN3），其余17个SNP位点均能够很好地检测出常见的三种基因型。17个SNP位点的平均个体检出率为96.35%，其中最高检出率为99.01%，最低检出率为 89.51%，各SNP位点具体检测结果详见表3所示。
17个成功检测的SNP位点中有8个（Hal、ADD1、FTO1、G9、G10、MSTN1、MyoG、RN2）为单态位点，即这些SNP位点在被检的大约克和长白样品中只有一种基因型，其余9个SNP位点（ACACA、MC4R、FTO2、G1、G2、G4、G6、G7、G8）在两个品种内均存在多态。利用皮尔逊卡方统计量对9个具有多态的SNP位点进行哈代-温伯格平衡检验，结果表明6个SNP位点处于哈代-温伯格平衡状态，其它3个SNP位点（G1、G2和G4）严重偏离哈代-温伯格平衡。
3讨论与结论
单核苷酸多态性（SNP）是基因组上广泛分布并能稳定遗传的DNA序列多态性。随着分子生物学技术的迅猛发展，产生了一系列能够实现大规模高通量的基因分型方法，如高通量测序技术、芯片技术和飞行时间质谱技术等。飞行时间质谱技术在SNP分型中表现出的高通量、准确性高、灵敏度高三大特点，及其较高的性价比，已成为众多科研人员进行SNP基因分型研究的首选[15，16]。本研究利用飞行时间质谱技术检测了大约克和长白群体799个样本的17个SNP位点，其检出率平均达96.35%，说明飞行时间质谱技术可实现位点和样本的高通量和自动化SNP分型。但应该指出的是，飞行时间质谱法是利用多重PCR反应的原理实现对多个SNP位点的同时检测，过多的引物在一个反应体系中容易形成引物二聚体，增加引物设计的难度。飞行时间质谱技术的这种局限性，有时会导致某些选定的SNP位点不能包括在同一个反应体系中。例如本研究中，预筛选时选择了24个SNP位点，但在设计特异性PCR引物和延伸引物时，4个位点（包括RN的1个SNP、MSTN的1个SNP、IGF2的1个SNP和G5位点）与其它位点的引物发生冲突，不能包含在检测范围内。 在通过文献和公共数据库进行显著效应SNP信息收集过程中，有些候选基因，如心脏脂肪酸结合蛋白基因[17]、钙蛋白酶抑制蛋白基因[18]和二酰基甘油酰基转移酶基因[19]等，利用的是基于PCR-RFLP方法进行的SNP基因分型，文献中没有具体的序列信息，不好确定SNP在基因组中的具体位置。我们曾经尝试用文献中提供的引物进行PCR测序，但结果不理想。另外，有些基因报道较多，但是不同研究者报道的基因效应不一致，故有几个常见猪生长和肉质相关基因排除在本研究之外。本研究中还有部分SNP来自于全基因组关联分析文章。全基因组关联分析是近几年发展起来的鉴定影响目标性状显著SNP的一种方法。但是目前，肉质性状的全基因组关联分析文章不多，而且有些文章[20，21]只给出了某个SNP位点的P值，没有指明SNP两个等位基因的效应，这样的文章对我们在SNP收集中参考意义也不大。
本研究中，17个成功检测的SNP位点中有8个为单态位点，这8个SNP位点均具有较大的效应。大约克和长白均是高度选育的商业化猪种，在长期的选择过程中，使这些发现较早且效应较大的SNP位点逐渐纯合。最显著的例子是氟烷基因（Hal）[2]，氟烷基因能够促进猪的肌肉生长，但是容易引起猪应激综合征。自从20世纪90年代发现氟烷基因编码蛋白的一个氨基酸突变（由精氨酸变成半肤氨酸）是导致猪应激综合征的原因以来，各育种公司利用MAS方法从群体中逐渐剔除了Hal的有害等位基因。另外9个多态SNP位点中，有3个SNP位点（G1、G2和G4）严重偏离哈代-温伯格平衡，说明这3个位点已经受到了高度选择。对于其它6个处于哈代-温伯格平衡状态的多态SNP位点，我们认为可能有两种原因，一是这些SNP是影响猪生长和肉质形状的显著SNP，但是效应较小；二是这些SNP具有多效性，使其在选育中受到的选育程度较轻。
总之，本研究利用飞行时间质谱技术成功检测了影响猪生长和肉质性状的17个SNP位点，建立了一套高通量、快速、准确的SNP检测平台，为今后建立猪生长和肉质性状遗传标记的开发和利用、加快猪的遗传研究进展奠定基础。
参考文献：
[1]
Zhang Z， Ding X， Liu J， et al. Accuracy of genomic prediction using low-density marker panels [J]. Journal of Dairy Science， 2011， 94（7）： 3642-3650.
[2]Fujii J， Otsu K， Zorzato F， et al. Identification of a mutation in porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia [J]. Science， 1991， 253（5018）： 448-451.
[3]Milan D， Jeon J T， Looft C， et al. A mutation in PRKAG3 associated with excess glycogen content in pig skeletal muscle [J]. Science， 2000， 288（5469）： 1248-1251.
[4]Stachowiak M， Nowacka-Woszuk J， Szydlowski M， et al. The ACACA and SREBF1 genes are promising markers for pig carcass and performance traits， but not for fatty acid content in the longissimus dorsi muscle and adipose tissue [J]. Meat Science， 2013， 95（1）： 64-71.
[5]Liu D， Xu Q， Zang L，et al. Identification and genetic effect of haplotypes in the promoter region of porcine myostatin gene [J]. Animal Genetics， 2011， 42（1）： 6-14.
[6]于灵芝， 唐辉， 王继英， 等. 肌肉生长抑制素基因 5′调控区的多态性与大白猪的早期生长有关[J]. 中国科学 （C）， 2007， 37（4）： 435-440.
[7]Piorkowska K， Tyra M， Rogoz M， et al. Association of the melanocortin-4 receptor （MC4R） with feed intake， growth， fatness and carcass composition in pigs raised in Poland [J]. Meat Science， 2010， 85（2）： 297-301.
[8]Te Pas M F W， Soumillion A， Harders F， et al. Influences of myogenin genotypes on birth weight， growth rate， carcass weight， backfat thickness， and lean weight of pigs [J]. Journal of Animal Science， 1999， 77（9）： 2352-2356.
[9]Fan B， Du Z Q， Rothschild M F. The fat mass and obesity-associated （FTO） gene is associated with intramuscular fat content and growth rate in the pig [J]. Animal Biotechnology， 2009， 20（2）： 58-70. [10]Dvorˇáková V， Bartenschlager H， Stratil A， et al. Association between polymorphism in the FTO gene and growth and carcass traits in pig crosses [J]. Genetics Selection Evolution， 2012， 44（1）： 13.
[11]Munoz G， Ovilo C， Silio L， et al. Single- and joint-population analyses of two experimental pig crosses to confirm quantitative trait loci on Sus scrofa chromosome 6 and leptin receptor effects on fatness and growth traits [J]. Journal of Animal Science， 2009， 87（2）： 459-468.
[12]Becker D， Wimmers K， Luther H， et al. A genome-wide association study to detect QTL for commercially important traits in Swiss Large White boars [J]. PloS ONE， 2013， 8（2）： e55951.
[13]Duijvesteijn N， Knol E F， Merks J W M， et al. A genome-wide association study on androstenone levels in pigs reveals a cluster of candidate genes on chromosome 6 [J]. BMC Genetics， 2010， 11（1）： 42.
[14]Ma J， Yang J， Zhou L， et al. Genome-wide association study of meat quality traits in a White Duroc × Erhualian F2 intercross and Chinese Sutai pigs [J]. PloS ONE， 2013， 8（5）： e64047.
[15]邓廷贤， 庞春英， 朱鹏， 等. 飞行时间质谱法检测水牛黑素皮质素受体4基因多态性[J]. 中国畜牧兽医， 2015， 42（7）：1800-1806.
[16]初芹， 李东， 侯诗宇， 等. 基于 DNA 池测序法筛选奶牛高信息量 SNP 标记的可行性[J]. 遗传， 2014， 36（7）： 691-696.
[17]Gerbens F， Van Erp A J， Harders F， et al. Effect of genetic variants of the heart fatty acid-binding protein gene on intramuscular fat and performance traits in pigs [J]. Journal of Animal Science， 1999， 77： 846-852.
[18]Ropka-Molik K， Bereta A， Tyra M， et al. Association of calpastatin gene polymorphisms and meat quality traits in pig [J]. Meat Science， 2014， 97（2）： 143-150.
[19]刘源. 猪DGAT基因的多态性与背膘厚的关系[D]. 泰安：山东农业大学， 2006.
[20]Yang B， Zhang W， Zhang Z， et al. Genome-wide association analyses for fatty acid composition in porcine muscle and abdominal fat tissues [J]. PloS ONE， 2013， 8（6）： e65554.
[21]Muoz M， Rodríguez M C， Alves E， et al. Genome-wide analysis of porcine backfat and intramuscular fat fatty acid composition using high-density genotyping and expression data [J]. BMC Genomics， 2013， 14（1）： 845.
关键词：猪；飞行时间质谱技术；单核苷酸多态性（SNP）；等位基因频率；标记辅助选择
中图分类号：S828.2文献标识号：A文章编号：1001-4942（2016）08-0128-06
AbstractIn the study， we collected the single nucleotide polymorphism （SNP） loci related with growth and meat quality of pigs by searching published papers and public databases. Based on the time-of-flight mass spectrometry （TOF-MS） technique， we genotyped the samples of Yorkshire （n=400） and Landrace （n=399）， and analyzed the genotype frequency， allele frequency， and Hardy-Weinberg Equilibrium testing of these SNPs. The results showed that using TOF-MS， we successfully genotyped 17 SNPs at the same time， and the average call rate of these SNPs was 96.35%. Nine of the 17 SNPs were polymorphic loci， and the other 8 were monomorphic loci， which had only one genotype in both Yorkshire and Landrace. Additionally， for the 9 polymorphic SNPs， 6 SNPs were in the Hardy-Weinberg Equilibrium and the other 3 deviated from it significantly. This study collected the significant SNPs related with growth and meat quality， and verified the effectiveness of genotyping multiple SNPs simultaneously and rapidly using TOF-MS， which provided foundations for the marker assisted selection （MAS） and the improvement of genetic progress of pigs.
KeywordsPig； Time-of-flight mass spectrometry （TOF-MS）； Single nucleotide polymorphism （SNP）； Allele frequency； Marker assisted selection （MAS）
近年来，随着分子遗传学的发展，遗传标记逐渐用于畜禽的标记辅助选择（marker assisted selection，MAS）育种中，以提高遗传选育的准确性。但是，对于数量性状，应用单个或者少数基因的MAS只能够解释很小比例的遗传变异，因此限制了标记辅助选择在畜禽育种中的应用。近年来发展起来的基于高密度SNP芯片的基因组选择技术克服了传统MAS的缺陷，但是其成本相对较高，对奶牛育种来说是可以承受的，对猪、鸡和羊等畜禽来说太高，在一定程度上影响了基因组选择在猪、鸡和羊等畜禽中的应用。
Zhang等[1]通过模拟研究表明，使用高密度芯片总标记数5%的标记即可获得高密度芯片95%的准确性，而且使用性状筛选标记效果要好于均匀分布的标记。随着分子遗传学的发展，广大科研工作者对影响猪繁殖、肉质和抗病等常规选育受到限制的性状基因进行了广泛的研究。通过候选基因、数量性状基因座（QTL）定位和全基因组关联分析等策略已经发现了数十个影响猪繁殖、肉质和抗病等性状的主效基因、QTL和DNA标记。本研究通过文献搜索，收集整理了对猪生长和肉质性状具有显著效应的单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism， SNP）位点，探讨利用飞行质谱技术进行多位点SNP快速分型的可行性，为今后建立猪生长和肉质性状标记辅助选择、加快猪的遗传研究进展奠定基础。
1材料与方法
1.1试验动物和样本采集
研究所测样品均来自山东省菏泽宏兴原种猪繁育有限公司，包括大约克（Yorkshire， n=400）和长白（Landrace， n=399）共799头仔猪。仔猪达35日龄时，每窝随机选取3～5头生长发育良好的健康仔猪，取耳组织，加入70%乙醇，-20℃保存备用。酚-氯仿法提取基因组DNA。利用1.5%琼脂糖凝胶电泳和Nanodrop进行DNA质量和浓度分析， -20℃储存备用。 1.2具有显著效应的猪生长和肉质性状SNP搜集
通过PubMed（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed）、中国知网（http：//www.cnki.net/）和dpSNP（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/index.html）等公共生物信息数据资源进行文献搜索和SNP信息收集，并通过不同来源信息的重复验证和筛选，获得对猪生长和肉质性状具有显著效应的SNP标记。
1.3SNP分型检测
基于Sequenom公司的MassArray iPLEX飞行时间质谱基因分型平台进行SNP分型检测。Sequenom MassArray SNP检测具体原理是先根据位点信息设计特异性PCR引物和延伸引物（具体引物信息如表2所示），将包含SNP位点区域的DNA模板通过PCR技术扩增，扩增产物以SAP酶去除多余dNTPs，然后对待检位点同时进行单碱基延伸，位点特异性延伸引物在突变位点处延伸一个碱基并终止，因此其可根据突变类型的差异而连接上不同的ddNTPs，形成分子量差异。延伸产物经过树脂纯化后，点样至靶片上，使用质谱仪对不同延伸产物的分子量进行检测，通过专用的分析软件MassArray Typer 4.0 进行处理，就可得到各突变位点的具体基因型。
1.4数据整理和统计分析
利用Excel 整理原始数据。利用皮尔逊卡方统计量对各SNP位点进行哈代-温伯格平衡检验，并利用Excel中的CHIDIST函数计算卡方值相应的P值。
皮尔逊卡方统计量定义为χ2=∑（O-E）2E，该式是对某一给定位点所有基因型的求和。式中O（Observed）代表每个基因型的观测数目，E（Expected）代表每个基因型在哈代-温伯格平衡定律成立的假定下的期望数目。
2结果与分析
2.1样本基因组DNA提取及检测
使用经典的酚-氯仿法提取猪耳组织样本中的基因组DNA。通过琼脂糖凝胶电泳检测，胶图显示DNA条带单一、清晰、无杂质，没有弥散、拖尾现象，说明DNA完整度好。通过Nanodrop紫外分光光度计法检测DNA的纯度和浓度，调整DNA终浓度在100 ng/μL左右，-20℃储存备用。
2.2影响猪生长和肉质性状的显著SNP搜集
通过对公共生物信息数据资源进行文献搜索，本研究共收集整理了24个SNP位点，其中14个SNP来自10个候选基因，包括氟烷基因（Hal，1个SNP）、酸肉基因（RN，2个SNP）、脂肪细胞决定和分化因子1基因（ADD1，1个SNP）、乙酰辅酶A羧化酶α基因（ACACA，1个SNP）、肌肉生长抑制素基因（MSTN，3个SNP）、胰岛素样生长因子2基因（IGF2，1个SNP）、黑素皮质素受体4基因（MC4R，1个SNP）、Leptin受体基因（LEPR，1个 SNP）、肌细胞生成素Myogenin 基因（MyoG，1个 SNP）、脂肪肥胖相关基因（FTO，2个SNP）；10个SNP来自3篇肉质相关的全基因组关联分析文章。24个SNP位点的具体信息详见表1所示。
根据位点信息设计特异性PCR引物和延伸引物时，有4个SNP位点与其它位点的引物发生冲突，包括RN的1个 SNP、MSTN的1个 SNP、IGF2的1个 SNP和 G5位点，没有包含在检测范围内。20个SNP位点在基因分型中所使用的引物信息详见表2所示。
2.3大约克和长白群体SNP分型结果
对本研究中大约克（n=400）和长白（n=399）共799个样本基因组DNA基于Sequenom公司的MassArray iPLEX飞行时间质谱基因分型平台进行SNP基因分型，20个检测位点中有3个分型失败（G3、LEPR和MSTN3），其余17个SNP位点均能够很好地检测出常见的三种基因型。17个SNP位点的平均个体检出率为96.35%，其中最高检出率为99.01%，最低检出率为 89.51%，各SNP位点具体检测结果详见表3所示。
17个成功检测的SNP位点中有8个（Hal、ADD1、FTO1、G9、G10、MSTN1、MyoG、RN2）为单态位点，即这些SNP位点在被检的大约克和长白样品中只有一种基因型，其余9个SNP位点（ACACA、MC4R、FTO2、G1、G2、G4、G6、G7、G8）在两个品种内均存在多态。利用皮尔逊卡方统计量对9个具有多态的SNP位点进行哈代-温伯格平衡检验，结果表明6个SNP位点处于哈代-温伯格平衡状态，其它3个SNP位点（G1、G2和G4）严重偏离哈代-温伯格平衡。
3讨论与结论
单核苷酸多态性（SNP）是基因组上广泛分布并能稳定遗传的DNA序列多态性。随着分子生物学技术的迅猛发展，产生了一系列能够实现大规模高通量的基因分型方法，如高通量测序技术、芯片技术和飞行时间质谱技术等。飞行时间质谱技术在SNP分型中表现出的高通量、准确性高、灵敏度高三大特点，及其较高的性价比，已成为众多科研人员进行SNP基因分型研究的首选[15，16]。本研究利用飞行时间质谱技术检测了大约克和长白群体799个样本的17个SNP位点，其检出率平均达96.35%，说明飞行时间质谱技术可实现位点和样本的高通量和自动化SNP分型。但应该指出的是，飞行时间质谱法是利用多重PCR反应的原理实现对多个SNP位点的同时检测，过多的引物在一个反应体系中容易形成引物二聚体，增加引物设计的难度。飞行时间质谱技术的这种局限性，有时会导致某些选定的SNP位点不能包括在同一个反应体系中。例如本研究中，预筛选时选择了24个SNP位点，但在设计特异性PCR引物和延伸引物时，4个位点（包括RN的1个SNP、MSTN的1个SNP、IGF2的1个SNP和G5位点）与其它位点的引物发生冲突，不能包含在检测范围内。 在通过文献和公共数据库进行显著效应SNP信息收集过程中，有些候选基因，如心脏脂肪酸结合蛋白基因[17]、钙蛋白酶抑制蛋白基因[18]和二酰基甘油酰基转移酶基因[19]等，利用的是基于PCR-RFLP方法进行的SNP基因分型，文献中没有具体的序列信息，不好确定SNP在基因组中的具体位置。我们曾经尝试用文献中提供的引物进行PCR测序，但结果不理想。另外，有些基因报道较多，但是不同研究者报道的基因效应不一致，故有几个常见猪生长和肉质相关基因排除在本研究之外。本研究中还有部分SNP来自于全基因组关联分析文章。全基因组关联分析是近几年发展起来的鉴定影响目标性状显著SNP的一种方法。但是目前，肉质性状的全基因组关联分析文章不多，而且有些文章[20，21]只给出了某个SNP位点的P值，没有指明SNP两个等位基因的效应，这样的文章对我们在SNP收集中参考意义也不大。
本研究中，17个成功检测的SNP位点中有8个为单态位点，这8个SNP位点均具有较大的效应。大约克和长白均是高度选育的商业化猪种，在长期的选择过程中，使这些发现较早且效应较大的SNP位点逐渐纯合。最显著的例子是氟烷基因（Hal）[2]，氟烷基因能够促进猪的肌肉生长，但是容易引起猪应激综合征。自从20世纪90年代发现氟烷基因编码蛋白的一个氨基酸突变（由精氨酸变成半肤氨酸）是导致猪应激综合征的原因以来，各育种公司利用MAS方法从群体中逐渐剔除了Hal的有害等位基因。另外9个多态SNP位点中，有3个SNP位点（G1、G2和G4）严重偏离哈代-温伯格平衡，说明这3个位点已经受到了高度选择。对于其它6个处于哈代-温伯格平衡状态的多态SNP位点，我们认为可能有两种原因，一是这些SNP是影响猪生长和肉质形状的显著SNP，但是效应较小；二是这些SNP具有多效性，使其在选育中受到的选育程度较轻。
总之，本研究利用飞行时间质谱技术成功检测了影响猪生长和肉质性状的17个SNP位点，建立了一套高通量、快速、准确的SNP检测平台，为今后建立猪生长和肉质性状遗传标记的开发和利用、加快猪的遗传研究进展奠定基础。
参考文献：
[1]
Zhang Z， Ding X， Liu J， et al. Accuracy of genomic prediction using low-density marker panels [J]. Journal of Dairy Science， 2011， 94（7）： 3642-3650.
[2]Fujii J， Otsu K， Zorzato F， et al. Identification of a mutation in porcine ryanodine receptor associated with malignant hyperthermia [J]. Science， 1991， 253（5018）： 448-451.
[3]Milan D， Jeon J T， Looft C， et al. A mutation in PRKAG3 associated with excess glycogen content in pig skeletal muscle [J]. Science， 2000， 288（5469）： 1248-1251.
[4]Stachowiak M， Nowacka-Woszuk J， Szydlowski M， et al. The ACACA and SREBF1 genes are promising markers for pig carcass and performance traits， but not for fatty acid content in the longissimus dorsi muscle and adipose tissue [J]. Meat Science， 2013， 95（1）： 64-71.
[5]Liu D， Xu Q， Zang L，et al. Identification and genetic effect of haplotypes in the promoter region of porcine myostatin gene [J]. Animal Genetics， 2011， 42（1）： 6-14.
[6]于灵芝， 唐辉， 王继英， 等. 肌肉生长抑制素基因 5′调控区的多态性与大白猪的早期生长有关[J]. 中国科学 （C）， 2007， 37（4）： 435-440.
[7]Piorkowska K， Tyra M， Rogoz M， et al. Association of the melanocortin-4 receptor （MC4R） with feed intake， growth， fatness and carcass composition in pigs raised in Poland [J]. Meat Science， 2010， 85（2）： 297-301.
[8]Te Pas M F W， Soumillion A， Harders F， et al. Influences of myogenin genotypes on birth weight， growth rate， carcass weight， backfat thickness， and lean weight of pigs [J]. Journal of Animal Science， 1999， 77（9）： 2352-2356.
[9]Fan B， Du Z Q， Rothschild M F. The fat mass and obesity-associated （FTO） gene is associated with intramuscular fat content and growth rate in the pig [J]. Animal Biotechnology， 2009， 20（2）： 58-70. [10]Dvorˇáková V， Bartenschlager H， Stratil A， et al. Association between polymorphism in the FTO gene and growth and carcass traits in pig crosses [J]. Genetics Selection Evolution， 2012， 44（1）： 13.
[11]Munoz G， Ovilo C， Silio L， et al. Single- and joint-population analyses of two experimental pig crosses to confirm quantitative trait loci on Sus scrofa chromosome 6 and leptin receptor effects on fatness and growth traits [J]. Journal of Animal Science， 2009， 87（2）： 459-468.
[12]Becker D， Wimmers K， Luther H， et al. A genome-wide association study to detect QTL for commercially important traits in Swiss Large White boars [J]. PloS ONE， 2013， 8（2）： e55951.
[13]Duijvesteijn N， Knol E F， Merks J W M， et al. A genome-wide association study on androstenone levels in pigs reveals a cluster of candidate genes on chromosome 6 [J]. BMC Genetics， 2010， 11（1）： 42.
[14]Ma J， Yang J， Zhou L， et al. Genome-wide association study of meat quality traits in a White Duroc × Erhualian F2 intercross and Chinese Sutai pigs [J]. PloS ONE， 2013， 8（5）： e64047.
[15]邓廷贤， 庞春英， 朱鹏， 等. 飞行时间质谱法检测水牛黑素皮质素受体4基因多态性[J]. 中国畜牧兽医， 2015， 42（7）：1800-1806.
[16]初芹， 李东， 侯诗宇， 等. 基于 DNA 池测序法筛选奶牛高信息量 SNP 标记的可行性[J]. 遗传， 2014， 36（7）： 691-696.
[17]Gerbens F， Van Erp A J， Harders F， et al. Effect of genetic variants of the heart fatty acid-binding protein gene on intramuscular fat and performance traits in pigs [J]. Journal of Animal Science， 1999， 77： 846-852.
[18]Ropka-Molik K， Bereta A， Tyra M， et al. Association of calpastatin gene polymorphisms and meat quality traits in pig [J]. Meat Science， 2014， 97（2）： 143-150.
[19]刘源. 猪DGAT基因的多态性与背膘厚的关系[D]. 泰安：山东农业大学， 2006.
[20]Yang B， Zhang W， Zhang Z， et al. Genome-wide association analyses for fatty acid composition in porcine muscle and abdominal fat tissues [J]. PloS ONE， 2013， 8（6）： e65554.
[21]Muoz M， Rodríguez M C， Alves E， et al. Genome-wide analysis of porcine backfat and intramuscular fat fatty acid composition using high-density genotyping and expression data [J]. BMC Genomics， 2013， 14（1）： 845.