【摘 要】
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目的:我们的目标是从源于胚胎体(EBs)的小鼠胚胎干细胞(mESCs)中分离运动神经元样细胞前体(MNLCPs),以用于发展针对运动神经元疾病的药物筛选试验和移植疗法.天然Shh蛋白(或S
【机 构】
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Carolinas Neuromuscular/ALS-MDA Center,Cannon Research Center
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目的:我们的目标是从源于胚胎体(EBs)的小鼠胚胎干细胞(mESCs)中分离运动神经元样细胞前体(MNLCPs),以用于发展针对运动神经元疾病的药物筛选试验和移植疗法.天然Shh蛋白(或Shh通路激动剂)和维甲酸诱导的胚胎体中,MNLCPs和未分化细胞的含量是不确定的.如果不把未分化的细胞从细胞培养中充分去除,其可能会干涉药物筛选试验或在移植后增生.我们开发了一种以密度梯度离心法为基础的富集MNLCPs的方法.方法:我们用Wichterle等人2008年改进的方法,将mESCs( HBG3:eGFP:HB9)扩大和分化.通过化学和酶学的无研磨处理,含有绿色荧光蛋白的MNLCPs和未分化细胞的胚胎体被小心轻轻地离解成单细胞.利用OptiprepTM8％～20％逐步梯度离心技术将MNLCPs回收.拥有绿色荧光蛋白的MNLCPs的含量由流式细胞仪检测.结果:我们的结果表明,在胚胎体形成前,mESCs在明胶包被的培养板上生长,其分化为MNLCPs的能力减少.比较mESCs在明胶,明胶与PMEFs,及PMEFs包被的培养板上的生长发现,mESCs在PMEFs包被的培养板上产生含绿色荧光蛋白的MNLCPs的得率为(54.1±11.0)％(x-±s;n=12),在明胶包被的培养板上的得率为(2.8±1.1)％(x-±s；n=9).用密度梯度离心法获得的含绿色荧光蛋白的MNLCPs的平均含量为(87.7±5.5)％(x-±s;n=3).结论:我们的数据表明,不使用细胞分选器,无研磨解离和密度梯度离心法也能用于富集具有高存活率的MNLCPs.有必要对MNLCPs在体外、体内和表型上进行进一步的生理学意义(如神经轴突的生长及形成神经肌肉接头的能力)上的鉴定.
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