【目的】了解施肥与土壤培肥和作物真菌病害的关系,为烤烟科学施肥、保持农业生产的长期可持续发展积累资料。【方法】利用云南省烟草农业科学研究院的长期肥料定位试验,设置长期不施肥(CK)、纯施化肥(CF)和有机无机肥配施(MCF)等处理,采用常规分析方法测定磷脂脂肪酸(PLFAs)和454高通量测序技术,分别就施肥对植烟土壤有机质、养分和微生物群落结构的影响进行分析。【结果】经16年长期施肥后,MCF使土壤有机质提高19.63%,有效磷增加;CF降低土壤有机质20.56%,碱解氮和有效钾减少。施肥显著增加微生物标记性磷脂脂肪酸(PLFAs)的种类和总量,尤以MCF最为显著,说明施肥尤其是MCF显著提高了土壤中微生物种群和数量。但是,在CF处理的土壤中,异养性微生物??真菌的PLFAs占微生物总量的比例是MCF的2.52倍,真菌种群数(OTUs)比MCF提高25.91%,真菌群落的多样性、均匀度和优势度指数也显著高于CK和MCF,说明施用化肥改变了土壤生态环境,有益于真菌生长繁殖,使真菌种群增加,密度增大,优势种群突出,导致土壤真菌化。土壤真菌群落由子囊菌门、担子菌门、接合菌门、壶菌门和尚待鉴定的真菌等构成,子囊菌门占绝大多数。前20种优势菌株的丰富度高达33.01%—49.28%,其中CK和MCF有15种相同,CK和CF仅6种一致。【结论】长期持续施用化肥可提高作物真菌病害的发生几率,降低土壤有机质;土壤特性是影响真菌种群的重要因素之一,MCF对土壤优势真菌的影响较小,而CF显著改变了土壤真菌的种群结构。