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摘要[目的]探索黔产吊石苣苔总黄酮的最佳提取工艺条件。[方法]以吊石苣苔总黄酮的提取率为考察指标，以乙醇为提取剂，采用单因素和正交试验考察了乙醇浓度、料液比、浸提次数、提取时间对吊石苣苔总黄酮提取率的影响。[结果]吊石苣苔总黄酮的最适宜提取工艺条件是乙醇浓度55%、料液比1∶20、提取时间2 h、浸提2次，在该条件下黔产吊石苣苔总黄酮提取率为5.152%。[结论]该工艺可为吊石苣苔的进一步综合开发提供参考。
关键词吊石苣苔；总黄酮；提取工艺；优化
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2016）10-163-03
Abstract[Objective] To explore the optimal extraction conditions of total flavonoids from L. pauciflorus. [Method] Extraction rate of total flavonoids from L. pauciflorus was used as the investigation index，single factor test and orthogonal test were carried out by using ethanol as the extraction solvent，so as to research the effects of ethanol concentration，solidliquid ratio，extraction time and extraction times on the extraction rate of total flavonoids. [Result] The optimal extraction conditions of total flavonoids from L. pauciflorus were as follows： 55% ethanol concentration，1∶20 solidliquid ratio，3 h extraction time and 2 extraction times. Under these conditions，extraction rate of total flavonoids could reach 5.152%. [Conclusion] This technology provides references for the further comprehensive development of L. pauciflorus.
Key wordsLysionotus pauciflorus； Total flavonoids； Extraction technology； Optimization
吊石苣苔廣泛分布于我国南方，如贵州、云南东部、四川、广西等省区[1-2]，生于丘陵或山地沟谷石崖上或树干上，因其具有清热、止咳、止血的功效，系贵州省苗族习用药材[3-4]。研究表明，吊石苣苔化学成分以黄酮类物质为主[5-6]。目前，关于吊石苣苔的研究主要集中在化学成分分析和抑菌活性作用[7-8]，未见吊石苣苔总黄酮提取工艺的相关报道。该研究以吊石苣苔总黄酮的提取率为考察指标，以乙醇为提取剂，采用单因素和正交试验考察了乙醇浓度、料液比、浸提次数及提取时间对吊石苣苔总黄酮提取率的影响，探索黔产吊石苣苔总黄酮的最佳提取工艺条件，以期更好地开发利用吊石苣苔。
1材料与方法
1.1试材吊石苣苔的全草；0.1 mg/mL的芦丁标准溶液、70%乙醇溶液、1 mol/L NaOH溶液、5%NaNO2溶液、10%Al（NO3）3溶液、石油醚。
1.2仪器TU1800pc紫外可见分光光度计，北京普析公司； RE52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。
1.3方法
1.3.1方法的线性关系。根据文献[9-10]方法，分别吸取0.1 mg/mL芦丁标准溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10 mL具塞比色管中，依次加入0.30 mL 5%NaNO2溶液、0.30 mL 10%Al（NO3）3溶液、4.00 mL 1 mol/L NaOH溶液，用70%乙醇溶液定容，摇匀后静置15 min。于510 nm波长处测定吸光度A，以吸光度A为纵坐标、标准溶液浓度C（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得到方法的线性回归方程A=16.694 0C-0.002 2（R2=0.998 3）。
1.3.2提取流程。将吊石苣苔洗净，低温烘干，用电动植物粉碎机粉碎。分别称取5.00 g干燥的吊石苣苔粉末，加入石油醚浸泡24 h，抽滤，滤渣低温烘干。加入适量的乙醇溶液，控制料液比，对滤渣进行回流提取，抽滤，滤液减压浓缩，得到吊石苣苔总黄酮粗提物，60 ℃下真空干燥后称重，记为m粗提物。
1.3.3总黄酮的测定及提取率的计算。称取吊石苣苔总黄酮粗提物10 mg，用70%乙醇溶解并定容至50.00 mL，作为供试品溶液。量取5.00 mL的供试品溶液（相当于粗提物1 mg），按“1.3.1”测定溶液的吸光度A，代入标准曲线方程即可换算出1 mg吊石苣苔总黄酮粗提物中总黄酮含量。则吊石苣苔总黄酮提取率的简化公式为：总黄酮提取率=[（m粗提物×C×V）/5]×100%。
1.3.4单因素试验。
1.3.4.1乙醇浓度。料液比为1∶10、提取时间1 h、浸提2次，考察乙醇浓度35%、45%、55%、65%、75%对吊石苣苔中总黄酮提取率的影响。
1.3.4.2料液比。用75%乙醇溶液、提取时间1 h、浸提2次，考察料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40对吊石苣苔中总黄酮提取率的影响。 1.3.4.3提取时间。用75%乙醇溶液、料液比1∶10、浸提2次，考察提取时间1、2、3、4 h对吊石苣苔中总黄酮提取率的影响。
1.3.4.4浸提次数。用75%乙醇溶液、料液比1∶10、提取时间1 h，分别浸提1、2、3、4次，考察提取次数对吊石苣苔中总黄酮提取率的影响。
1.3.5正交试验。以总黄酮提取率为考察指标，根据单因素试验结果，选取乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）、浸提次数（D）为4个考察因素，将各考察因素取3个水平进行了L9（34）正交试验设计（表1），筛选最佳提取条件。
2结果与分析
2.1单因素试验由图1可知，当乙醇浓度55%、料液比1∶20、提取时间3 h时提取率最大。因为乙醇浓度太低，料液比低于1∶20，提取时间太短，黄酮类物质的溶出有限。但乙醇浓度太高、料液比>1∶20、提取时间太长，浸出液中非黄酮类物质的浓度也增加，协同竞争，反而影响黄酮类物质的溶出，且不利于分离过滤。
随浸提次数的增加，吊石苣苔总黄酮提取率也逐渐升高，但浸提3、4次得到的提取率差异不显著，浸提次数增加不仅浪费试剂，且延长操作时间。综合考虑选择浸提2次。
2.2正交试验由表2中极差分析可知，各主次因素是B>D>C>A，即料液比>浸提次数>提取时间>乙醇浓度。在所选因素水平下4种因素的优化工艺组合为乙醇浓度55%、料液比1∶20、提取时间2 h、浸提2次。
2.3验证试验按上述优化工艺对黔产吊石苣苔中总黄酮进行提取，3次平行验证，得到吊石苣苔总黄酮的提取率分别为5.296%、5.147%、5.015%，平均提取率为5.152%，RSD为2.73%。
3结论
该研究以吊石苣苔总黄酮的提取率为考察指标，以乙醇为提取剂，采用单因素和正交试验考察了乙醇浓度、料液比、浸提次数及提取时间对吊石苣苔总黄酮提取率的影响，探索黔产吊石苣苔总黄酮的最佳提取工艺条件。结果表明，黔产吊石苣苔总黄酮的最佳提取工艺条件是以乙醇浓度55%为提取溶剂，料液比1∶20、提取时间2 h、浸提2次，在该条件下吊石苣苔总黄酮平均提取率为5.152%。贵州山区生长有大量的吊石苣苔，该工艺可为吊石苣苔的进一步综合开发提供参考。
参考文献
[1] 中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴：第4册[M].北京：科学出版社，2002：119.
[2] 中国植物志编委会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1990：136.
[3] 马竣，冉懋雄.贵州苗族医药研究与开发[M].贵阳：贵州科技出版社，1999：141.
[4] 孙超，张勇民.贵州特有药用植物资源与可持续利用评价[J].中草药，2004，35（11）：1311-1315.
[5] 冯卫生，李倩，郑晓珂.吊石苣苔的化学成分研究[J].中国药学杂志，2007，42（5）：337-338.
[6] LIU Y，WANGNER H，BAUER R.Phenylpropanoids and flavonoidglycosides from Lysionotus pauciflorus[J].Phytochemistry，1998，48（2）：339-343.
[7] 魏金鳳，陈林，王金梅，等.髯丝蛛毛苣苔和吊石苣苔抗菌活性成分研究[J].中国中药杂志，2011，36（17）：1975-1978.
[8] 汪志勇，江峰，徐红，等.苗药吊石苣苔的抑菌活性研究[J].安徽农业科学，2015，22（43）：64-66.
[9] 郑媛媛，李辰，封士兰，等.油橄榄叶中总黄酮含量测定方法探讨[J].光谱学与光谱分析，2011，31（2）：547-550.
[10] 王自军，杨红兵，齐誉，等.正交设计研究石韦总黄酮和鞣质提取工艺[J].时珍国医国药，2007，18（2）：463.44
关键词吊石苣苔；总黄酮；提取工艺；优化
中图分类号S567文献标识码A文章编号0517-6611（2016）10-163-03
Abstract[Objective] To explore the optimal extraction conditions of total flavonoids from L. pauciflorus. [Method] Extraction rate of total flavonoids from L. pauciflorus was used as the investigation index，single factor test and orthogonal test were carried out by using ethanol as the extraction solvent，so as to research the effects of ethanol concentration，solidliquid ratio，extraction time and extraction times on the extraction rate of total flavonoids. [Result] The optimal extraction conditions of total flavonoids from L. pauciflorus were as follows： 55% ethanol concentration，1∶20 solidliquid ratio，3 h extraction time and 2 extraction times. Under these conditions，extraction rate of total flavonoids could reach 5.152%. [Conclusion] This technology provides references for the further comprehensive development of L. pauciflorus.
Key wordsLysionotus pauciflorus； Total flavonoids； Extraction technology； Optimization
吊石苣苔廣泛分布于我国南方，如贵州、云南东部、四川、广西等省区[1-2]，生于丘陵或山地沟谷石崖上或树干上，因其具有清热、止咳、止血的功效，系贵州省苗族习用药材[3-4]。研究表明，吊石苣苔化学成分以黄酮类物质为主[5-6]。目前，关于吊石苣苔的研究主要集中在化学成分分析和抑菌活性作用[7-8]，未见吊石苣苔总黄酮提取工艺的相关报道。该研究以吊石苣苔总黄酮的提取率为考察指标，以乙醇为提取剂，采用单因素和正交试验考察了乙醇浓度、料液比、浸提次数及提取时间对吊石苣苔总黄酮提取率的影响，探索黔产吊石苣苔总黄酮的最佳提取工艺条件，以期更好地开发利用吊石苣苔。
1材料与方法
1.1试材吊石苣苔的全草；0.1 mg/mL的芦丁标准溶液、70%乙醇溶液、1 mol/L NaOH溶液、5%NaNO2溶液、10%Al（NO3）3溶液、石油醚。
1.2仪器TU1800pc紫外可见分光光度计，北京普析公司； RE52AA旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂。
1.3方法
1.3.1方法的线性关系。根据文献[9-10]方法，分别吸取0.1 mg/mL芦丁标准溶液0、1.00、2.00、3.00、4.00、5.00 mL于10 mL具塞比色管中，依次加入0.30 mL 5%NaNO2溶液、0.30 mL 10%Al（NO3）3溶液、4.00 mL 1 mol/L NaOH溶液，用70%乙醇溶液定容，摇匀后静置15 min。于510 nm波长处测定吸光度A，以吸光度A为纵坐标、标准溶液浓度C（mg/mL）为横坐标绘制标准曲线，得到方法的线性回归方程A=16.694 0C-0.002 2（R2=0.998 3）。
1.3.2提取流程。将吊石苣苔洗净，低温烘干，用电动植物粉碎机粉碎。分别称取5.00 g干燥的吊石苣苔粉末，加入石油醚浸泡24 h，抽滤，滤渣低温烘干。加入适量的乙醇溶液，控制料液比，对滤渣进行回流提取，抽滤，滤液减压浓缩，得到吊石苣苔总黄酮粗提物，60 ℃下真空干燥后称重，记为m粗提物。
1.3.3总黄酮的测定及提取率的计算。称取吊石苣苔总黄酮粗提物10 mg，用70%乙醇溶解并定容至50.00 mL，作为供试品溶液。量取5.00 mL的供试品溶液（相当于粗提物1 mg），按“1.3.1”测定溶液的吸光度A，代入标准曲线方程即可换算出1 mg吊石苣苔总黄酮粗提物中总黄酮含量。则吊石苣苔总黄酮提取率的简化公式为：总黄酮提取率=[（m粗提物×C×V）/5]×100%。
1.3.4单因素试验。
1.3.4.1乙醇浓度。料液比为1∶10、提取时间1 h、浸提2次，考察乙醇浓度35%、45%、55%、65%、75%对吊石苣苔中总黄酮提取率的影响。
1.3.4.2料液比。用75%乙醇溶液、提取时间1 h、浸提2次，考察料液比1∶10、1∶20、1∶30、1∶40对吊石苣苔中总黄酮提取率的影响。 1.3.4.3提取时间。用75%乙醇溶液、料液比1∶10、浸提2次，考察提取时间1、2、3、4 h对吊石苣苔中总黄酮提取率的影响。
1.3.4.4浸提次数。用75%乙醇溶液、料液比1∶10、提取时间1 h，分别浸提1、2、3、4次，考察提取次数对吊石苣苔中总黄酮提取率的影响。
1.3.5正交试验。以总黄酮提取率为考察指标，根据单因素试验结果，选取乙醇浓度（A）、料液比（B）、提取时间（C）、浸提次数（D）为4个考察因素，将各考察因素取3个水平进行了L9（34）正交试验设计（表1），筛选最佳提取条件。
2结果与分析
2.1单因素试验由图1可知，当乙醇浓度55%、料液比1∶20、提取时间3 h时提取率最大。因为乙醇浓度太低，料液比低于1∶20，提取时间太短，黄酮类物质的溶出有限。但乙醇浓度太高、料液比>1∶20、提取时间太长，浸出液中非黄酮类物质的浓度也增加，协同竞争，反而影响黄酮类物质的溶出，且不利于分离过滤。
随浸提次数的增加，吊石苣苔总黄酮提取率也逐渐升高，但浸提3、4次得到的提取率差异不显著，浸提次数增加不仅浪费试剂，且延长操作时间。综合考虑选择浸提2次。
2.2正交试验由表2中极差分析可知，各主次因素是B>D>C>A，即料液比>浸提次数>提取时间>乙醇浓度。在所选因素水平下4种因素的优化工艺组合为乙醇浓度55%、料液比1∶20、提取时间2 h、浸提2次。
2.3验证试验按上述优化工艺对黔产吊石苣苔中总黄酮进行提取，3次平行验证，得到吊石苣苔总黄酮的提取率分别为5.296%、5.147%、5.015%，平均提取率为5.152%，RSD为2.73%。
3结论
该研究以吊石苣苔总黄酮的提取率为考察指标，以乙醇为提取剂，采用单因素和正交试验考察了乙醇浓度、料液比、浸提次数及提取时间对吊石苣苔总黄酮提取率的影响，探索黔产吊石苣苔总黄酮的最佳提取工艺条件。结果表明，黔产吊石苣苔总黄酮的最佳提取工艺条件是以乙醇浓度55%为提取溶剂，料液比1∶20、提取时间2 h、浸提2次，在该条件下吊石苣苔总黄酮平均提取率为5.152%。贵州山区生长有大量的吊石苣苔，该工艺可为吊石苣苔的进一步综合开发提供参考。
参考文献
[1] 中国科学院植物研究所.中国高等植物图鉴：第4册[M].北京：科学出版社，2002：119.
[2] 中国植物志编委会.中国植物志[M].北京：科学出版社，1990：136.
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[4] 孙超，张勇民.贵州特有药用植物资源与可持续利用评价[J].中草药，2004，35（11）：1311-1315.
[5] 冯卫生，李倩，郑晓珂.吊石苣苔的化学成分研究[J].中国药学杂志，2007，42（5）：337-338.
[6] LIU Y，WANGNER H，BAUER R.Phenylpropanoids and flavonoidglycosides from Lysionotus pauciflorus[J].Phytochemistry，1998，48（2）：339-343.
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[8] 汪志勇，江峰，徐红，等.苗药吊石苣苔的抑菌活性研究[J].安徽农业科学，2015，22（43）：64-66.
[9] 郑媛媛，李辰，封士兰，等.油橄榄叶中总黄酮含量测定方法探讨[J].光谱学与光谱分析，2011，31（2）：547-550.
[10] 王自军，杨红兵，齐誉，等.正交设计研究石韦总黄酮和鞣质提取工艺[J].时珍国医国药，2007，18（2）：463.44