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【摘要】目的：探究由壳聚糖、胶原和睫状神经营养因子（CNTF）制成的复合神经导管修复大鼠周围神经缺损的可行性。方法：采用冷冻干燥法制备复合神经导管，并进行导管降解实验。取30只SD大鼠随机均分为3组：自体神经移植组（A组）、壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管组（B组）、壳聚糖-胶原导管加管内一次性给CNTF组 （C组） ，制作坐骨神经10 mm缺损，按上述分组进行桥接。术后3个月进行大体观察、神经电生理测定、组织学检测、图像分析。结果:壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管约13周完全降解。术后3个月时3组大鼠术侧后肢运动功能所改善，A组、B组较好，均好于C组。两组复合导管基本降解管内的再生神经己经完整地连接神经断端。电生理测定、组织学检测、图像分析显示：A组和B组神经传导速度、再生神经的数量、质量无显著性差异（P>0.05）,而A组和B组数据均优于C组（P<0.05）。结论:壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管能有效的修复大鼠坐骨神经10 mm缺损，效果接近自体神经移植，优于管内一次性给CNTF的壳聚糖-胶原复合神经导管。
【关键词】壳聚糖；胶原；睫状神经营养因子；神经导管；神经缺损
【中图分类号】R651.3【文献标识码】B【文章编号】1008-6455（2011）08-0043-02
chitosan-collagen-CNTF composite never conduit prepairing peripheral nerve defect in rats
Li Chi Zhang Jiren Huang Qinbei Bai Guang
【Abstract】Objective:To explore the feasibility of chitosan-collagen-CNTF composite never conduit prepairing sciatic nerve defect in rats. Methods:Using freeze-dried method to make composite never conduits.the degradation test was perfoemed by weight loss measurements in 0.01mol/L phosphate-buffered saline （PBS） solution.Thirty Sprague-Dawley（SD） rats randomly were averagely divided into three groups, autograft nerve （group A）, chitosan-collagen-CNTF composite nerve conduit （group B）, chitosan-collagen composite nerve conduit and only once injection of CNTF into conduit （group C）. Each rat underwent left sciatic nerve transection and left a 10 mm nerve defect, and then they were treated respectively according to the above mentioned three experimental groups. three months later after operation ,foot ulceration, gait, joint movement of rats were observed. composite never conduits and nerve regeneration were observed by Electrophysiological observation: nerve conductive velocity （NCV） was measured. Part of specimens were examined to know status about myelin sheaths by electron microscope.Results:The chitosan-collage-CNTF composite never conduits were fully degraded after about 13 weeks in PBS solution. Observation improvement of flexing and contractive limb were found after 3 months, groups A and B were better than group C. At this time, the proximal nerve regenerated through the conduit cavity.Through Electrophysiological observation. histological and ultrastructural morphology, in regard to nerve conduction velocity and axon counting there was no significant difference between group A and group B （P>0.05），while the data of group A and group B were significantly better than those of group C（P<0.05）. Conclusion:schitosan-collagen-CNTF composite never conduitcould effectively repair 10 mm long rats’sciatic nerve defect, as well as autograft nerve, and had the better effect on promoting peripheral nerve to regenerate.
【Key words】chitosan；collagen；ciliary neurotrophic factor；nerve conduit；nerve defect
周圍神经缺损在现代生产生活中极为常见，对于少量缺损可行断端无张力的缝合，对于较大范围的缺损，自体神经移植是目前临床治疗的首选方法，也是研究其他治疗方法的“金标准”[1]。然而长段的外周神经移植物较难找到，且存在供区神经瘤形成和运动、感觉障碍等并发症, 故这种方法难以推广。
1 实验材料与方法
1.1 壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管与壳聚糖-胶原复合神经导管的制备:取50μg CNTF冻干粉用生理盐水溶解成25μg/ml溶液2ml，并迅速以1g壳聚糖:50μgCNTF:2gI型胶原与上述试剂混在一起，以磁力搅拌器混匀。浇于自制导管模具中，利用冷冻干燥技术制成管长12mm、壁厚0.3mm、内径1.5mm的壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管。用三蒸水4℃漂洗三次，随后行冷冻干燥24小时得到二次冻干后的导管, 钴60照射灭菌30min后，分袋密封，4℃保存待用。同样的按1g壳聚糖:2gI型胶原用上述冷冻干燥法制成相同规格的壳聚糖-胶原复合神经导管。
1.2 大鼠坐骨神经缺损模型的制作:雄性健康成年SD大鼠30只，体重250-300g,随机分为A、B、C三组，每组l0只。即：自体神经移植组（A组）、壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管组（B组）、壳聚糖-胶原复合神经导管+导管内一次性给CNTF组（C组）。以10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3ml/kg），无菌条件下由左股二头肌与股外侧肌间隙分离显露大鼠左侧坐骨神经。A组于坐骨神经中段切取神经干10mm，近、远端颠倒后10-0无损伤线两端各缝合4针。B、C组锐性切除坐骨神经干6mm，将导管两端各插入1mm，造成10mm缺损。10-0无损伤线导管两端各缝合4针。缝合前C组导管组中注人含CNTF 500ng生理盐水5μl。
1.3 检测指标
1.3.1 壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管体外降解率、降解时间的测定:随机选取10根复合导管样品，电子天平称五次取平均值W1（降解前重量）。一個试管中放一段样品，加入15ml 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液 PBS（pH7.40），恒温孵育（T37℃ ）。每隔两天换液一次。30天后收集剩余试管内导管，冻干，称重五次取平均值W2（降解后30天重量）。将W1及W2代入下列公式计算降解率: 降解率（%）（W1-W2）/W1×100%
1.3.2 大体观察:术后定期观察各组伤口愈合、术侧足底皮肤溃疡情况，步态、后肢肌肉萎缩程度及关节僵直屈伸情况。取标本前观察神经导管与神经、周围组织的关系。
1.3.3 电生理测定:术后3个月取标本之前，然后将刺激电极置于导管近端的神经干上，在小腿三头肌处插入记录电极，采用四通道肌电图仪检测运动神经传导速度 。
1.3.4 组织学检测:术后3个月大鼠处死。切取左侧坐骨神经桥接物中段进行组织学检测：光镜观察：将取得标本固定，包埋，连续横断面切片（厚度5μm），行HE染色。电镜观察：所取得标本常规固定、包埋，LKB-V型超薄切片机切片（厚度50-70nm），铀、铅染色，JEM―1200EX型电镜观察再生神经的超微结构。
1.3.5 图像分析:采用北航医学图像分析系统对HE染色横断面切片进行光镜下计算机图像分析。测定再生神经中远段有髓神经纤维的数目、直径、髓鞘厚度。
1.3.6 统计学分析:数据采用SPSS 11.5进行单因素方差分析（P<0.05有统计学意义）。
2 结果
2.1 壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管体外降解率与降解时间的测定:通过随机选的10个壳聚糖-胶原-CNTF复合导管样品30天后冻干称重与实验前比较，可计算出复合导管降解率为23.8%，13周时降解完全。
2.2 大体观察:术后第二周，各组大鼠切口完全愈合，术侧足趾均出现红肿，走路术侧腿拖曳。术后一个月时，各组大鼠术侧膝关节和足趾均不能，伸足底出现红肿、溃疡，小腿有不同程度的肌肉萎缩，自体移植组术侧小腿肌萎缩较另外两组轻。术后两个月，A组4只，B组5只，C组7只术侧足趾出现萎缩，足底的红肿、溃疡和小腿部的肌肉萎缩仍存在。3月个月时3组大鼠术侧足底的红肿、溃疡消失，膝关节屈曲软缩、肌肉萎缩均有所改善，A组、B组较好，好于C组。此时取材时见复合导管基本降解完毕，与周围组织轻度粘连，再生神经均已通过所有神经导管。
2.3 电生理检查.见表1。
2.4 组织学检测:横切面进行形态学观察。镜下见，所有导管均基本降解，并有神经纤维长入导管。HE染色切片可见B组再生的神经纤维较多，且排列整齐，神经数量和轴突粗细，与A组无显著性差异，C组可见许多结缔组织浸润，神经纤维数量少，排列紊乱，轴突较为细小。电镜观察,A组和B组再生的有髓神经纤维多，髓鞘完整，板层排列紧密，轴突膜与髓鞘膜紧密相邻，髓鞘形成好，比C组厚且完整。见表2
表1 术后3个月时电生理检查NCV结果（x±s）
注：A组和B组差异无显著性（P>0.05），B组和C组有显著性差异（P<0.05）
表2 术后3个月后的再生神经组织学观察图像分析 （x±s）
注：B组再生有髓神经纤维数目、直径、鞘厚度都显著优于C组（P<0.05 ）；与A组结果相近，差异无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
3.1 壳聚糖和胶原的选用:实验中我们使用壳聚糖、胶原为导管材料是因为这两种材料经过人们的不断研究和改进已具备了许多优越的特性。我国科研工作者率先应用几丁质制成神经导管来修复周围神经缺损获得成功。但此种导管存在脆性大、吸收降解快等缺点，于是人们将几丁质脱乙酰基得到的壳聚糖制成神经导管，该导管较之几丁质导管更具韧性，脆性有所降低，同时良好的组织相容性能促雪旺细胞生长、分裂，抑制成纤维细胞生长，能有效的防止神经瘤的形成[2]。胶原是细胞外基质的主要成分，作为一种可吸收降解材料，广泛应用于各种外科修复，在神经再生过程中参与基质桥的形成，同时促进细胞的生长和分化，利于轴突爬行延伸[3]。
3.2 CNTF的缓释和促神经再生作用:神经导管促进受损神经的成功再生，导管内微环境亦起到至关重要的作用。研究表明NTF可通过逆向轴索运输作用于胞体，增强神经元功能，从而促进周围神经的再生[4]。因此在导管加入的外源性NTF可达到改善微环境更好的促进神经再生的目的。
我们制成的壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管，随着壳聚糖-胶原载体的缓慢降解吸收，CNTF连续释放，形成一种缓释系统，使CNTF能长时间发挥作用，促进周围神经再生。虽然CNTF释放速度同样会随着其在载体中的含量下降而下降，但随着导管逐渐降解，导管结构逐渐变得疏松，而药物分子在管壁中扩散、溶解及释放的阻力减小，结果可以加快药物的释放速度，从而使导管内保持较恒定的药物浓度。复合导管制作过程中，我们采用冷冻干燥法制备导管，避免了以往在制备导管过程中使用一些有机溶剂，因为NTF在有机溶剂中会失活或凝聚，从而最大限度保护CNTF的生物活性。本实验中，壳聚糖－胶原-CNTF复合导管，在体外13周完全降解，术后3个月取材时也导管已基本降解，也就是说理论上CNTF3个月内在一个较恒定的浓度上释放完全，从而满足了修复大鼠10mm神经缺损促进神经再生的需求。从B组与C组的结果来看，术后3个月B组的神经纤维的数目、直径、髓鞘厚度以及神经传导速度均不同程度优于C 组，与自体神经移植组结果相当，说明了壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管能缓释CNTF，更有效地促进神经再生。但是聚糖-胶原-CNTF复合神经导管中的CNTF剂量是参照文献报道的剂量，于适当增加的，而具体哪一种剂量疗效最佳，还有待进一步研究。
4 结论
壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管具有良好的组织相容性，能有效的修复大鼠坐骨神经10 mm缺损，效果接近自体神经移植，优于导管内一次性给CNTF的壳聚糖-胶原复合神经导管，因此壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管有望应用于临床治疗周围神经缺损。
参考文献
[1] Flores AJ,Lavernia CJ,Owens PW,Anatomy and phiology of peripheral nerve injury and repair.Am J Orthop,2000,29（3）:16
[2] 苟三怀,候春林,王东英,等. 几丁质桥接周围神经缺损的实验研究及临床应用.中华骨科杂志,1996,16（3）:148-151
[3] T. Kiyotani. M Teramachi.Y. Takirnoto.et al. Nerve regeneration across 25mm gap bridged by a polyglycolic acid collagen tube:a histological evaluation of regeneration nerves.BrainRes.1996,33:66-74
[4] Cameron NE, Eaton SE ,Cotter MA et al. Vascular factors and metabolic interactions in the pathogenes is of diabetic neuropathy.Diabetologia, 2001,44:1973-1976
【关键词】壳聚糖；胶原；睫状神经营养因子；神经导管；神经缺损
【中图分类号】R651.3【文献标识码】B【文章编号】1008-6455（2011）08-0043-02
chitosan-collagen-CNTF composite never conduit prepairing peripheral nerve defect in rats
Li Chi Zhang Jiren Huang Qinbei Bai Guang
【Abstract】Objective:To explore the feasibility of chitosan-collagen-CNTF composite never conduit prepairing sciatic nerve defect in rats. Methods:Using freeze-dried method to make composite never conduits.the degradation test was perfoemed by weight loss measurements in 0.01mol/L phosphate-buffered saline （PBS） solution.Thirty Sprague-Dawley（SD） rats randomly were averagely divided into three groups, autograft nerve （group A）, chitosan-collagen-CNTF composite nerve conduit （group B）, chitosan-collagen composite nerve conduit and only once injection of CNTF into conduit （group C）. Each rat underwent left sciatic nerve transection and left a 10 mm nerve defect, and then they were treated respectively according to the above mentioned three experimental groups. three months later after operation ,foot ulceration, gait, joint movement of rats were observed. composite never conduits and nerve regeneration were observed by Electrophysiological observation: nerve conductive velocity （NCV） was measured. Part of specimens were examined to know status about myelin sheaths by electron microscope.Results:The chitosan-collage-CNTF composite never conduits were fully degraded after about 13 weeks in PBS solution. Observation improvement of flexing and contractive limb were found after 3 months, groups A and B were better than group C. At this time, the proximal nerve regenerated through the conduit cavity.Through Electrophysiological observation. histological and ultrastructural morphology, in regard to nerve conduction velocity and axon counting there was no significant difference between group A and group B （P>0.05），while the data of group A and group B were significantly better than those of group C（P<0.05）. Conclusion:schitosan-collagen-CNTF composite never conduitcould effectively repair 10 mm long rats’sciatic nerve defect, as well as autograft nerve, and had the better effect on promoting peripheral nerve to regenerate.
【Key words】chitosan；collagen；ciliary neurotrophic factor；nerve conduit；nerve defect
周圍神经缺损在现代生产生活中极为常见，对于少量缺损可行断端无张力的缝合，对于较大范围的缺损，自体神经移植是目前临床治疗的首选方法，也是研究其他治疗方法的“金标准”[1]。然而长段的外周神经移植物较难找到，且存在供区神经瘤形成和运动、感觉障碍等并发症, 故这种方法难以推广。
1 实验材料与方法
1.1 壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管与壳聚糖-胶原复合神经导管的制备:取50μg CNTF冻干粉用生理盐水溶解成25μg/ml溶液2ml，并迅速以1g壳聚糖:50μgCNTF:2gI型胶原与上述试剂混在一起，以磁力搅拌器混匀。浇于自制导管模具中，利用冷冻干燥技术制成管长12mm、壁厚0.3mm、内径1.5mm的壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管。用三蒸水4℃漂洗三次，随后行冷冻干燥24小时得到二次冻干后的导管, 钴60照射灭菌30min后，分袋密封，4℃保存待用。同样的按1g壳聚糖:2gI型胶原用上述冷冻干燥法制成相同规格的壳聚糖-胶原复合神经导管。
1.2 大鼠坐骨神经缺损模型的制作:雄性健康成年SD大鼠30只，体重250-300g,随机分为A、B、C三组，每组l0只。即：自体神经移植组（A组）、壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管组（B组）、壳聚糖-胶原复合神经导管+导管内一次性给CNTF组（C组）。以10%水合氯醛腹腔注射麻醉（3ml/kg），无菌条件下由左股二头肌与股外侧肌间隙分离显露大鼠左侧坐骨神经。A组于坐骨神经中段切取神经干10mm，近、远端颠倒后10-0无损伤线两端各缝合4针。B、C组锐性切除坐骨神经干6mm，将导管两端各插入1mm，造成10mm缺损。10-0无损伤线导管两端各缝合4针。缝合前C组导管组中注人含CNTF 500ng生理盐水5μl。
1.3 检测指标
1.3.1 壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管体外降解率、降解时间的测定:随机选取10根复合导管样品，电子天平称五次取平均值W1（降解前重量）。一個试管中放一段样品，加入15ml 0.01 mol/L磷酸盐缓冲液 PBS（pH7.40），恒温孵育（T37℃ ）。每隔两天换液一次。30天后收集剩余试管内导管，冻干，称重五次取平均值W2（降解后30天重量）。将W1及W2代入下列公式计算降解率: 降解率（%）（W1-W2）/W1×100%
1.3.2 大体观察:术后定期观察各组伤口愈合、术侧足底皮肤溃疡情况，步态、后肢肌肉萎缩程度及关节僵直屈伸情况。取标本前观察神经导管与神经、周围组织的关系。
1.3.3 电生理测定:术后3个月取标本之前，然后将刺激电极置于导管近端的神经干上，在小腿三头肌处插入记录电极，采用四通道肌电图仪检测运动神经传导速度 。
1.3.4 组织学检测:术后3个月大鼠处死。切取左侧坐骨神经桥接物中段进行组织学检测：光镜观察：将取得标本固定，包埋，连续横断面切片（厚度5μm），行HE染色。电镜观察：所取得标本常规固定、包埋，LKB-V型超薄切片机切片（厚度50-70nm），铀、铅染色，JEM―1200EX型电镜观察再生神经的超微结构。
1.3.5 图像分析:采用北航医学图像分析系统对HE染色横断面切片进行光镜下计算机图像分析。测定再生神经中远段有髓神经纤维的数目、直径、髓鞘厚度。
1.3.6 统计学分析:数据采用SPSS 11.5进行单因素方差分析（P<0.05有统计学意义）。
2 结果
2.1 壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管体外降解率与降解时间的测定:通过随机选的10个壳聚糖-胶原-CNTF复合导管样品30天后冻干称重与实验前比较，可计算出复合导管降解率为23.8%，13周时降解完全。
2.2 大体观察:术后第二周，各组大鼠切口完全愈合，术侧足趾均出现红肿，走路术侧腿拖曳。术后一个月时，各组大鼠术侧膝关节和足趾均不能，伸足底出现红肿、溃疡，小腿有不同程度的肌肉萎缩，自体移植组术侧小腿肌萎缩较另外两组轻。术后两个月，A组4只，B组5只，C组7只术侧足趾出现萎缩，足底的红肿、溃疡和小腿部的肌肉萎缩仍存在。3月个月时3组大鼠术侧足底的红肿、溃疡消失，膝关节屈曲软缩、肌肉萎缩均有所改善，A组、B组较好，好于C组。此时取材时见复合导管基本降解完毕，与周围组织轻度粘连，再生神经均已通过所有神经导管。
2.3 电生理检查.见表1。
2.4 组织学检测:横切面进行形态学观察。镜下见，所有导管均基本降解，并有神经纤维长入导管。HE染色切片可见B组再生的神经纤维较多，且排列整齐，神经数量和轴突粗细，与A组无显著性差异，C组可见许多结缔组织浸润，神经纤维数量少，排列紊乱，轴突较为细小。电镜观察,A组和B组再生的有髓神经纤维多，髓鞘完整，板层排列紧密，轴突膜与髓鞘膜紧密相邻，髓鞘形成好，比C组厚且完整。见表2
表1 术后3个月时电生理检查NCV结果（x±s）
注：A组和B组差异无显著性（P>0.05），B组和C组有显著性差异（P<0.05）
表2 术后3个月后的再生神经组织学观察图像分析 （x±s）
注：B组再生有髓神经纤维数目、直径、鞘厚度都显著优于C组（P<0.05 ）；与A组结果相近，差异无统计学意义（P>0.05）。
3 讨论
3.1 壳聚糖和胶原的选用:实验中我们使用壳聚糖、胶原为导管材料是因为这两种材料经过人们的不断研究和改进已具备了许多优越的特性。我国科研工作者率先应用几丁质制成神经导管来修复周围神经缺损获得成功。但此种导管存在脆性大、吸收降解快等缺点，于是人们将几丁质脱乙酰基得到的壳聚糖制成神经导管，该导管较之几丁质导管更具韧性，脆性有所降低，同时良好的组织相容性能促雪旺细胞生长、分裂，抑制成纤维细胞生长，能有效的防止神经瘤的形成[2]。胶原是细胞外基质的主要成分，作为一种可吸收降解材料，广泛应用于各种外科修复，在神经再生过程中参与基质桥的形成，同时促进细胞的生长和分化，利于轴突爬行延伸[3]。
3.2 CNTF的缓释和促神经再生作用:神经导管促进受损神经的成功再生，导管内微环境亦起到至关重要的作用。研究表明NTF可通过逆向轴索运输作用于胞体，增强神经元功能，从而促进周围神经的再生[4]。因此在导管加入的外源性NTF可达到改善微环境更好的促进神经再生的目的。
我们制成的壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管，随着壳聚糖-胶原载体的缓慢降解吸收，CNTF连续释放，形成一种缓释系统，使CNTF能长时间发挥作用，促进周围神经再生。虽然CNTF释放速度同样会随着其在载体中的含量下降而下降，但随着导管逐渐降解，导管结构逐渐变得疏松，而药物分子在管壁中扩散、溶解及释放的阻力减小，结果可以加快药物的释放速度，从而使导管内保持较恒定的药物浓度。复合导管制作过程中，我们采用冷冻干燥法制备导管，避免了以往在制备导管过程中使用一些有机溶剂，因为NTF在有机溶剂中会失活或凝聚，从而最大限度保护CNTF的生物活性。本实验中，壳聚糖－胶原-CNTF复合导管，在体外13周完全降解，术后3个月取材时也导管已基本降解，也就是说理论上CNTF3个月内在一个较恒定的浓度上释放完全，从而满足了修复大鼠10mm神经缺损促进神经再生的需求。从B组与C组的结果来看，术后3个月B组的神经纤维的数目、直径、髓鞘厚度以及神经传导速度均不同程度优于C 组，与自体神经移植组结果相当，说明了壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管能缓释CNTF，更有效地促进神经再生。但是聚糖-胶原-CNTF复合神经导管中的CNTF剂量是参照文献报道的剂量，于适当增加的，而具体哪一种剂量疗效最佳，还有待进一步研究。
4 结论
壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管具有良好的组织相容性，能有效的修复大鼠坐骨神经10 mm缺损，效果接近自体神经移植，优于导管内一次性给CNTF的壳聚糖-胶原复合神经导管，因此壳聚糖-胶原-CNTF复合神经导管有望应用于临床治疗周围神经缺损。
参考文献
[1] Flores AJ,Lavernia CJ,Owens PW,Anatomy and phiology of peripheral nerve injury and repair.Am J Orthop,2000,29（3）:16
[2] 苟三怀,候春林,王东英,等. 几丁质桥接周围神经缺损的实验研究及临床应用.中华骨科杂志,1996,16（3）:148-151
[3] T. Kiyotani. M Teramachi.Y. Takirnoto.et al. Nerve regeneration across 25mm gap bridged by a polyglycolic acid collagen tube:a histological evaluation of regeneration nerves.BrainRes.1996,33:66-74
[4] Cameron NE, Eaton SE ,Cotter MA et al. Vascular factors and metabolic interactions in the pathogenes is of diabetic neuropathy.Diabetologia, 2001,44:1973-1976