论文部分内容阅读
摘要[目的]对采自内蒙古根河地区的灰紫香蘑进行组织分离与鉴定。[方法]分别选取菌盖处、菌褶与菌柄交界处和菌柄处进行组织分离，将分离物进行ITS序列分析，计算遗传距离，并采用邻接法构建NJ系统发育树。[结果]菌褶与菌柄交界处为最佳分离部位，菌丝生长速度快、洁白细密、污染率低；其次，子实体自然风干3 d后再进行分离可有效降低菌丝污染程度；最后分离物经ITS序列测定，系统发育分析证实其为灰紫香蘑。[结论]该方法获得了灰紫香蘑的纯培养菌株，为进一步开发和利用灰紫香蘑提供了科学依据。
关键词灰紫香蘑（Lepista glaucocana）；组织分离；ITS序列鉴定；系统发育分析
中图分类号S646文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04192-02
Isolation and Identification of Lepista glaucocana by ITS Gene Sequence
TANG Qingming et al （Hulun Buir Forestry Bureau，Hulun Buir，Inner Mongolia 021008）
Abstract [Objective] To isolate，cultivate and accurately identify Lepista glaucocana which was collected from Genhe district in Inner Mongolia. [Method] Different tissues from pileus，stipe，junction of pileus and stipe were isolated，then the isolate was identified by internal transcribed spacer （ITS），the genetic distance was calculated，and a NJ systematic tree was established by the neighborjoining method. [Result] The results showed that junction of pileus and stipe is the best isolation position，which mycelia with fast growth and low pollution； Secondly，it is lower pollution when airdry the fruiting body for 3 days； At last，the isolate was identified as L.glaucocana analyzed by phylogenetic relationship of ITS gene sequences. [Conclusion] The pure strain was obtained which can provide a scientific basis for development and use of L. glaucocana.
Key words Lepista glaucocana； Tissue isolation； ITS sequence； Phylogenetic relationship
灰紫香蘑（Lepista glaucocana）隶属于真菌门（Enmycophyta）担子菌亚门（Basidiomycotina）层菌纲（Hymenomycetes），伞菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）香蘑属（Lepista）[1]。子实体中等稍大、菌盖淡紫色或丁香紫色，后褪至白色，是一种优良的食用菌。其气味浓香，色泽宜人，鲜食、干食风味俱佳，是具有很高开发价值的优质野生食用菌资源[2]。目前，灰紫香蘑的报道不多，人工驯化方面还未取得实质性进展，虽有对灰紫香蘑菌丝体分离的研究报道[2-3]，但关于其对得到的菌丝体进行鉴定的研究鲜有报道。为了保护及开发利用该资源，笔者采用组织分离法对灰紫香蘑进行了菌种分离纯化及ITS序列鉴定，以期为进一步开发和利用灰紫香蘑提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料以2013年9月采自内蒙古根河地区的灰紫香蘑作为供试菌种，试验材料应选择朵型正常、无病虫害、无破损和生长健壮的灰紫香蘑子实体。
1.2方法
1.2.1培养基的制备。PDA培养基：马铃薯200 g（去皮），葡萄糖20 g，琼脂15 g，水1 000 ml，pH自然。
1.2.2不同组织部位对分离的影响。在超净工作台上进行组织分离，将子实体用浓度75%的乙醇擦拭表面2～3遍；用灭过菌的解剖刀沿菌菇纵向划开小口，用手轻轻掰开；用接种钩在菌盖处、菌褶和菌柄交界处及菌柄处钩取一块菌肉组织；将其迅速移入预先制备好的PDA平板培养基上，每皿接4块菌肉组织，设置3组重复，放入25 ℃恒温培养箱内避光培养，观察各组织部位的长势情况。
1.2.3子实体风干程度对分离的影响。分别分离新鲜的子实体和经过自然风干3 d的子实体，各接4块菌肉组织于PDA平板培养基上，设置3组重复，置于25 ℃恒温条件下避光培养，观察并记录菌丝污染情况。
1.2.4基因组DNA的提取、扩增及鉴定。采用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒（天根）分别对灰紫香蘑的子实体和分离培养得到的菌丝体进行基因组DNA的提取。用消过毒的接种钩钩取子实体菌褶内纯净的菌肉，放于研钵中，加入液氮充分研磨。刮取分离菌株培养基上的菌丝体，放于研钵中，加入液氮充分研磨。其余步骤参照说明书。
图3子实体及其分离菌株的rDNA ITS扩增图谱图4NJ法构建系统发育树2.4系统发育分析在NCBI中，进行BLASTN搜索，得到的同源序列主要是同属和近缘属的不同种，其中与Lepista nuda的相似度最高为99%，但在比对结果中未发现灰紫香蘑的ITS序列。下载上述相似物种中有代表性的ITS序列，用Clustal X 2.0软件进行序列比对，并辅以人工修正。基于来自NCBI中的7个种的ITS序列，以子囊菌亚门的冬虫夏草（Cordyceps sinensis）作为外参，连同试验中的ITS序列共9个序列一起用于系统发育分析。用MEGA 4.0中的邻接法（NJ）构建系统树。图4表明，M2与香蘑属的Lepista nuda具有较近的系统发育关系，其次是Tricholoma mongolicum和Lepista sordida；与近缘属的Clitocybe subditopoda、Collybia tuberosa序列差异较大，系统发育关系較远。 3结论与讨论
对于食用菌的人工驯化，首先需要解决食用菌的菌种分离问题。常见的菌种分离方法主要有组织分离法、孢子分离法和基内菌丝分离法3种。其中组织分离法因操作简单，纯化率高在实践中被广泛地应用[6]。试验采用组织分离法对灰紫香蘑子实体不同部位进行的分离试验结果表明，野生灰紫香蘑可在实验室条件下成功分离且菌褶和菌柄交界处为最佳分离部位，菌丝不但生长致密洁白、生长速度快，并且子实体自然风干3 d后再进行组织分离，菌丝培养较不易受杂菌污染。
目前菌种鉴定，遗传多样性研究主要基于形态学水平、细胞水平、生化水平及分子水平得以开展[7]，其中ITS序列分析法因准确性高，简便易行而具有很大的实用价值。由于ITS区不加入成熟核糖体，所以ITS片段在进化过程中承受的自然选择压力非常小，因此能容忍更多的变异[8]。在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性，即使是亲缘关系非常接近的2个种都能在ITS序列上表现出差异，显示最近的进化特征[9]。通过对供试子实体与菌丝体ITS区段长度比对，验证了供试菌丝体就是灰紫香蘑的分离物。把待测真菌ITS区段的DNA扩增出来，并测出其序列，然后与数据库中的资料进行比对，即可确定供试真菌的分类地位。这种鉴定方法允许少量的序列分析误差或少量错配，不僅用于分类鉴定，还可对真菌类群作系统发育分析。借助于ITS序列分析法，构建了系统发育树，拟从分子水平上揭示野生菌株的遗传背景，反映种间的遗传亲缘关系，为进一步资源保护、驯化和开发利用等工作奠定基础。
参考文献
[1] 卯晓岚.中国大型真菌 [M] .郑州：河南科学技术出版社，2000.
[2] 栾庆书，金若忠，云丽丽.灰紫香蘑分离及生物学测定及扩繁培养[J].中国食用菌，2006，25（5）：23-26.
[3] 王树海.灰紫香蘑的分离培养[J].中国林副特产，2006（4）：32-33.
[4] WHITE T J，BRUNS T ，LEE S，et al.Analysis of phytogenetic relationships by amplification and direct sequencing of ribosomal RNA genes[C]//A Guide to Methods and Applications.New York：Academic Press，1990：315-322.
[5] 冯晓宇.内蒙古灰紫香蘑生物学特性及栽培技术的研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2010.
[6] 任桂梅，赵海鹰，邓振山，等.菌种分离技术及其降低污染率与死亡率实验教改初探[J].延安大学学报：自然科学版，2007，26 （4）：65-67.
[7] 张靠稳，杨振华，马爱瑛.标记技术在食用菌遗传多样性中的研究进展[J].贵州农业科学，2010，38（6）：6-9.
[8] 陈剑山，郑服丛.ITS序列分析在真菌分类鉴定中的应用[J].安徽农业科学，2007，35（13）：3785-3786，3792.
[9] FRANEK M，KOLAR V，GRANATOVA M，et al.Monoclonal ELISA for 2，4dichloroPhenoxyacetic acid：Characterization of antibodies and assay optioization[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1994，42：1369-1374.
关键词灰紫香蘑（Lepista glaucocana）；组织分离；ITS序列鉴定；系统发育分析
中图分类号S646文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04192-02
Isolation and Identification of Lepista glaucocana by ITS Gene Sequence
TANG Qingming et al （Hulun Buir Forestry Bureau，Hulun Buir，Inner Mongolia 021008）
Abstract [Objective] To isolate，cultivate and accurately identify Lepista glaucocana which was collected from Genhe district in Inner Mongolia. [Method] Different tissues from pileus，stipe，junction of pileus and stipe were isolated，then the isolate was identified by internal transcribed spacer （ITS），the genetic distance was calculated，and a NJ systematic tree was established by the neighborjoining method. [Result] The results showed that junction of pileus and stipe is the best isolation position，which mycelia with fast growth and low pollution； Secondly，it is lower pollution when airdry the fruiting body for 3 days； At last，the isolate was identified as L.glaucocana analyzed by phylogenetic relationship of ITS gene sequences. [Conclusion] The pure strain was obtained which can provide a scientific basis for development and use of L. glaucocana.
Key words Lepista glaucocana； Tissue isolation； ITS sequence； Phylogenetic relationship
灰紫香蘑（Lepista glaucocana）隶属于真菌门（Enmycophyta）担子菌亚门（Basidiomycotina）层菌纲（Hymenomycetes），伞菌目（Agaricales）口蘑科（Tricholomataceae）香蘑属（Lepista）[1]。子实体中等稍大、菌盖淡紫色或丁香紫色，后褪至白色，是一种优良的食用菌。其气味浓香，色泽宜人，鲜食、干食风味俱佳，是具有很高开发价值的优质野生食用菌资源[2]。目前，灰紫香蘑的报道不多，人工驯化方面还未取得实质性进展，虽有对灰紫香蘑菌丝体分离的研究报道[2-3]，但关于其对得到的菌丝体进行鉴定的研究鲜有报道。为了保护及开发利用该资源，笔者采用组织分离法对灰紫香蘑进行了菌种分离纯化及ITS序列鉴定，以期为进一步开发和利用灰紫香蘑提供科学依据。
1材料与方法
1.1材料以2013年9月采自内蒙古根河地区的灰紫香蘑作为供试菌种，试验材料应选择朵型正常、无病虫害、无破损和生长健壮的灰紫香蘑子实体。
1.2方法
1.2.1培养基的制备。PDA培养基：马铃薯200 g（去皮），葡萄糖20 g，琼脂15 g，水1 000 ml，pH自然。
1.2.2不同组织部位对分离的影响。在超净工作台上进行组织分离，将子实体用浓度75%的乙醇擦拭表面2～3遍；用灭过菌的解剖刀沿菌菇纵向划开小口，用手轻轻掰开；用接种钩在菌盖处、菌褶和菌柄交界处及菌柄处钩取一块菌肉组织；将其迅速移入预先制备好的PDA平板培养基上，每皿接4块菌肉组织，设置3组重复，放入25 ℃恒温培养箱内避光培养，观察各组织部位的长势情况。
1.2.3子实体风干程度对分离的影响。分别分离新鲜的子实体和经过自然风干3 d的子实体，各接4块菌肉组织于PDA平板培养基上，设置3组重复，置于25 ℃恒温条件下避光培养，观察并记录菌丝污染情况。
1.2.4基因组DNA的提取、扩增及鉴定。采用快捷型植物基因组DNA提取试剂盒（天根）分别对灰紫香蘑的子实体和分离培养得到的菌丝体进行基因组DNA的提取。用消过毒的接种钩钩取子实体菌褶内纯净的菌肉，放于研钵中，加入液氮充分研磨。刮取分离菌株培养基上的菌丝体，放于研钵中，加入液氮充分研磨。其余步骤参照说明书。
图3子实体及其分离菌株的rDNA ITS扩增图谱图4NJ法构建系统发育树2.4系统发育分析在NCBI中，进行BLASTN搜索，得到的同源序列主要是同属和近缘属的不同种，其中与Lepista nuda的相似度最高为99%，但在比对结果中未发现灰紫香蘑的ITS序列。下载上述相似物种中有代表性的ITS序列，用Clustal X 2.0软件进行序列比对，并辅以人工修正。基于来自NCBI中的7个种的ITS序列，以子囊菌亚门的冬虫夏草（Cordyceps sinensis）作为外参，连同试验中的ITS序列共9个序列一起用于系统发育分析。用MEGA 4.0中的邻接法（NJ）构建系统树。图4表明，M2与香蘑属的Lepista nuda具有较近的系统发育关系，其次是Tricholoma mongolicum和Lepista sordida；与近缘属的Clitocybe subditopoda、Collybia tuberosa序列差异较大，系统发育关系較远。 3结论与讨论
对于食用菌的人工驯化，首先需要解决食用菌的菌种分离问题。常见的菌种分离方法主要有组织分离法、孢子分离法和基内菌丝分离法3种。其中组织分离法因操作简单，纯化率高在实践中被广泛地应用[6]。试验采用组织分离法对灰紫香蘑子实体不同部位进行的分离试验结果表明，野生灰紫香蘑可在实验室条件下成功分离且菌褶和菌柄交界处为最佳分离部位，菌丝不但生长致密洁白、生长速度快，并且子实体自然风干3 d后再进行组织分离，菌丝培养较不易受杂菌污染。
目前菌种鉴定，遗传多样性研究主要基于形态学水平、细胞水平、生化水平及分子水平得以开展[7]，其中ITS序列分析法因准确性高，简便易行而具有很大的实用价值。由于ITS区不加入成熟核糖体，所以ITS片段在进化过程中承受的自然选择压力非常小，因此能容忍更多的变异[8]。在绝大多数的真核生物中表现出了极为广泛的序列多态性，即使是亲缘关系非常接近的2个种都能在ITS序列上表现出差异，显示最近的进化特征[9]。通过对供试子实体与菌丝体ITS区段长度比对，验证了供试菌丝体就是灰紫香蘑的分离物。把待测真菌ITS区段的DNA扩增出来，并测出其序列，然后与数据库中的资料进行比对，即可确定供试真菌的分类地位。这种鉴定方法允许少量的序列分析误差或少量错配，不僅用于分类鉴定，还可对真菌类群作系统发育分析。借助于ITS序列分析法，构建了系统发育树，拟从分子水平上揭示野生菌株的遗传背景，反映种间的遗传亲缘关系，为进一步资源保护、驯化和开发利用等工作奠定基础。
参考文献
[1] 卯晓岚.中国大型真菌 [M] .郑州：河南科学技术出版社，2000.
[2] 栾庆书，金若忠，云丽丽.灰紫香蘑分离及生物学测定及扩繁培养[J].中国食用菌，2006，25（5）：23-26.
[3] 王树海.灰紫香蘑的分离培养[J].中国林副特产，2006（4）：32-33.
[4] WHITE T J，BRUNS T ，LEE S，et al.Analysis of phytogenetic relationships by amplification and direct sequencing of ribosomal RNA genes[C]//A Guide to Methods and Applications.New York：Academic Press，1990：315-322.
[5] 冯晓宇.内蒙古灰紫香蘑生物学特性及栽培技术的研究[D].哈尔滨：东北林业大学，2010.
[6] 任桂梅，赵海鹰，邓振山，等.菌种分离技术及其降低污染率与死亡率实验教改初探[J].延安大学学报：自然科学版，2007，26 （4）：65-67.
[7] 张靠稳，杨振华，马爱瑛.标记技术在食用菌遗传多样性中的研究进展[J].贵州农业科学，2010，38（6）：6-9.
[8] 陈剑山，郑服丛.ITS序列分析在真菌分类鉴定中的应用[J].安徽农业科学，2007，35（13）：3785-3786，3792.
[9] FRANEK M，KOLAR V，GRANATOVA M，et al.Monoclonal ELISA for 2，4dichloroPhenoxyacetic acid：Characterization of antibodies and assay optioization[J].Journal of Agricultural and Food Chemistry，1994，42：1369-1374.