【摘 要】
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目的 检测新构建肝型丙酮酸激酶启动子(LPKp)与人胰岛素基因(hInsg)逆转录病毒表达载体(pM54,LPKp-hlnsg)在pT67、HepG2细胞的表达情况,为基因治疗或基因结合干细胞治疗糖尿
【机 构】
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解放军总医院内分泌科,美国耶鲁大学医学院内分泌学系,美国耶鲁大学医学院实验室医学系
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目的 检测新构建肝型丙酮酸激酶启动子(LPKp)与人胰岛素基因(hInsg)逆转录病毒表达载体(pM54,LPKp-hlnsg)在pT67、HepG2细胞的表达情况,为基因治疗或基因结合干细胞治疗糖尿病寻找新的优化生物载体. 方法 (1)限制酶切父、母本质粒p54、pMDN-SIN,取相关片段构建含人Ins基因-逆转录病毒载体pM54(pMDN-SIN+p54;LPKwhlnsg);pM54扩增、纯化、酶切鉴定;(2)脂质体FuGENE 6转染pM54质粒进入pT67、Phoenix E和3T3细胞系,同时转染pCMVβGal和父本质粒p54做对照;(3)制备转染后细胞培养拟逆转录病毒上清液;(4)用转染后细胞培养上清液旋转感染pT67、HepG2细胞;(5)ELISA法检测转染、感染后细胞培养上清液Ins含量. 结果 酶切鉴定质粒与构建预期相符;ELISA法检测出转染、感染上清液中均含较高水平Ins.对照结果均为阴性. 结论 LPKp-hInsg基因逆转录病毒表达载体pM54构建成功.人胰岛素基因逆转录病毒介导旋转感染pT67等细胞,目的 蛋白Ins获得了预期的表达.实验为基因治疗或基因结合干细胞治疗糖尿病的进一步相关研究奠定了基础.
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