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【摘 要】 脓毒性脑病是决定脓毒症致死率的关键因素。但脓毒血性脑病的发生，发展及其分子机制目前不清楚明了。本研究里，成功构建小鼠脓毒症模型，证明了在脓毒性脑病过程中，相关的蛋白表达。目的： 深入地了解探究脑内炎症反应及其相关蛋白的相互作用。方法先对小鼠进行脓毒症造模然后再在对小鼠进行组织相关的蛋白质提取对提取出来的相关蛋白进行Western blot法检测蛋白表达的实验结果最后进行统计学处理得出最后的结论。
【关键词】 脓毒性脑病 相关的蛋白 Western Blot 印迹方法
1 研究概况
脓毒症是通过感染而引起的全身炎症反应综合征，实验也明确了脓毒症患者体内存在细菌。虽然是因为感染造成脓毒症，但是发病后，其发生有其自身的规律和病理过程，所以脓毒症实质是机体对感染后因素的自身反应。
脓毒症是现代医学的重点研究方向。脓毒症和继发的多脏器功能障碍综合征己经变成如今医院病房的主要死亡原因（占50%～80%）[1]。即使采用了综合性治疗方法，脓毒症及MODS的死亡率和发病率仍然很高。由脓毒症诱发的临床综合征表现为血管功能不良、器官衰竭，具有很高的病死率[2]。国际著名脓毒症研究专家联手，最近在Nature Medicine 撰文指出，应该重视脓毒症的发病机制，加速研制药物速度，然后进行运用。
2 方法
对小鼠进行脓毒症造模术前12 h禁食，自由饮水。腹腔注射水合氯醛，手术区域备皮，常规消毒，于前腹正中切口，使盲肠暴露，再用环形结扎盲肠根部，针头于盲端部通透穿孔，将排泄物部分放出。还纳肠管，丝线逐层缝合关腹。手术完成后皮下注射生理盐水，肌肉注射青霉素用于预防切口感染。sham组仅开腹，游离盲肠，然后关腹。Sham组和CLP组于模型制备前lh时腹腔注射等容量生理盐水，缝合前在手术局部使用庆大霉素，消毒缝合颈部皮肤。
组织蛋白提取和Western blot法检测蛋白表达a.组织蛋白质提取将小鼠头部截断，取其脑，在冰上对其皮层脑部组织进行分开，然后将其放置在冻存管，再将冻存管保管到液氮中，最后储存到冰箱中保存，用来提取总蛋白。将样本用切碎，按照7倍的体积加入总蛋白的提取液。在把组织放入超声仪器中匀浆完全破碎，在4℃的环境中放置，离心取出上清液，分装后冻存。b. Western blot法检测蛋白表达制备不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶，填满后把梳子插进浓缩胶内，等到浓缩胶成固态时，用双手分别把住梳子两边笔直向上慢慢把它拉出，将浓缩胶用水清洗，然后放进电泳槽内。取每组总蛋白相同体积上样缓冲溶液混合，煮沸，让蛋白变性完全，离心，上样在凝胶加样孔中。给浓缩胶加上80V电压，当染料前端到达分离胶时，迅速将电压增至100V，溴酚兰移动到胶底部后停止电泳，大约需要100分钟。完成电泳后剥胶，按照蛋白Marker切胶，将三层滤纸、PVDF膜、胶、及其他三层滤纸在转膜缓冲液内浸泡后并按顺序从正极向负极叠放，在恒定压力转膜2小时，把凝胶上的蛋白质全部移至PVDF膜。用丽春红S染PVDF膜2-5min，再使用去离子水漂洗至脱去颜色，最后鉴定转膜是否成功。5%脱脂奶粉室温封闭PVDF膜1h，一抗根据不同抗体说明书比例用1×TPBS溶液稀释，将膜加上对应的一抗，摇床上室温4℃孵育过夜，TPBS洗膜5次，每次5min，室温孵育二抗2h，TPBS洗膜4次，每次5min。用EZ-ECL试剂盒孵育1min，暗室中用X-射线感光胶片曝光，全自动胶片冲洗机冲洗胶片，蛋白条带用Epson扫描仪扫描，用Gelpro-32蛋白处理软件进行光密度分析。
统计学处理运用SPSS16.0统计学软件进行数据分析，各项结果全部用Mean土S.E.M.表示，多组数据进行比较可以采用方差进行分析，同时进行方差齐性检验，当P<0.05时符合统计学规定，具有统计学意义。
3 结果
3.1 小鼠膿毒症模型的建立，为证明是否造模成功
利用心包穿刺术抽取小鼠的血液样本进行了内毒素浓度的检测。结果显示，CLP模型组小鼠中的内毒素水平明显高于阴性对照组，数据统计结果也显示具有统计学意义。脓毒症小鼠出现了眼部周围充满脓性分泌物，常的躁动、甚至出现嗜睡、昏睡和昏迷。这些结果都显示，CLP模型符合脓毒性脑病的病理生理学的研究。
3.2 血脑屏障（BBB）关联蛋白的变化
我们检测了正常组与小鼠CLP模型组，BBB的相关蛋白（ZO-1，Claudin-5）在大脑皮层区的表达变化。结果显示与正常组相比，CLP造模组中，ZO-1与Claudin-5蛋白表达量上升，由此推测在脓毒症早期，血脑屏障被破坏。Fas及其配体Fas？L是诱导编程性死亡的细胞表面分子。Westen Blot结果显示在模型组中，Fas蛋白表达上升，Fas的配体Fas Ligind蛋白表达无变化。
3.4 金属蛋白酶MMP-9蛋白变化
结果显示，与阴性对照组相比，在模型组中金属蛋白酶MMP-9的蛋白表达上升。
4 结论与阴性对照组相比
脓毒症1h后，小鼠大脑皮层区的BBB的相关蛋白（ZO-1，Claudin-5），Fas及金属蛋白酶MMP-9蛋白表达上升，而Fas的配体Fas Ligind蛋白表达基本无变化。这些结果显示ZO-1，Claudin-5，Fas及金属蛋白酶MMP-9都可能参与到小鼠脓毒症的发病过程中。
参考文献
[1]Papadopoulos MC， Davies DC， Moss RF， Tighe D， Bennett ED. Pathophysiology of septic encephalopathy： a review. Crit Care Med. 2000；28（8）：3019-3024.
[2]Ginès P， Fernández J， Durand F， Saliba F. Management of critically-ill cirrhotic patients. J Hepatol. 2012；56 Suppl 1：S13-24.
[3]Gustot T， Durand F， Lebrec D， Vincent JL， Moreau R. Severe sepsis in cirrhosis. Hepatology. 2009；50（6）：2022-2033.
[4]Kathleen R， Melinda W M， Roxanne K， Sarah C P W. Focus on sepsis. Nat Med. 2012；18（7）：997-1002.
[5]Weberpals M， Hermes M， Hermann S， Kummer MP， Terwel D， Semmler A， Berger M， Sch？fers M， Heneka MT. NOS2 gene deficiency protects from sepsis-induced long-term cognitive deficits. J Neurosci. 2009；29（45）：14177-14184.
[6]Goodwin JE， Feng Y， Velazquez H， Sessa WC. Endothelial glucocorticoid receptor is required for protection against sepsis. Proc Natl Acad Sci USA. 2013；110（1）：306-311.
作者简介：弓淼（1993.12-），男，籍贯：陕西省榆林市，学历：本科，研究方向：生物工程.
【关键词】 脓毒性脑病 相关的蛋白 Western Blot 印迹方法
1 研究概况
脓毒症是通过感染而引起的全身炎症反应综合征，实验也明确了脓毒症患者体内存在细菌。虽然是因为感染造成脓毒症，但是发病后，其发生有其自身的规律和病理过程，所以脓毒症实质是机体对感染后因素的自身反应。
脓毒症是现代医学的重点研究方向。脓毒症和继发的多脏器功能障碍综合征己经变成如今医院病房的主要死亡原因（占50%～80%）[1]。即使采用了综合性治疗方法，脓毒症及MODS的死亡率和发病率仍然很高。由脓毒症诱发的临床综合征表现为血管功能不良、器官衰竭，具有很高的病死率[2]。国际著名脓毒症研究专家联手，最近在Nature Medicine 撰文指出，应该重视脓毒症的发病机制，加速研制药物速度，然后进行运用。
2 方法
对小鼠进行脓毒症造模术前12 h禁食，自由饮水。腹腔注射水合氯醛，手术区域备皮，常规消毒，于前腹正中切口，使盲肠暴露，再用环形结扎盲肠根部，针头于盲端部通透穿孔，将排泄物部分放出。还纳肠管，丝线逐层缝合关腹。手术完成后皮下注射生理盐水，肌肉注射青霉素用于预防切口感染。sham组仅开腹，游离盲肠，然后关腹。Sham组和CLP组于模型制备前lh时腹腔注射等容量生理盐水，缝合前在手术局部使用庆大霉素，消毒缝合颈部皮肤。
组织蛋白提取和Western blot法检测蛋白表达a.组织蛋白质提取将小鼠头部截断，取其脑，在冰上对其皮层脑部组织进行分开，然后将其放置在冻存管，再将冻存管保管到液氮中，最后储存到冰箱中保存，用来提取总蛋白。将样本用切碎，按照7倍的体积加入总蛋白的提取液。在把组织放入超声仪器中匀浆完全破碎，在4℃的环境中放置，离心取出上清液，分装后冻存。b. Western blot法检测蛋白表达制备不连续SDS-聚丙烯酰胺凝胶，填满后把梳子插进浓缩胶内，等到浓缩胶成固态时，用双手分别把住梳子两边笔直向上慢慢把它拉出，将浓缩胶用水清洗，然后放进电泳槽内。取每组总蛋白相同体积上样缓冲溶液混合，煮沸，让蛋白变性完全，离心，上样在凝胶加样孔中。给浓缩胶加上80V电压，当染料前端到达分离胶时，迅速将电压增至100V，溴酚兰移动到胶底部后停止电泳，大约需要100分钟。完成电泳后剥胶，按照蛋白Marker切胶，将三层滤纸、PVDF膜、胶、及其他三层滤纸在转膜缓冲液内浸泡后并按顺序从正极向负极叠放，在恒定压力转膜2小时，把凝胶上的蛋白质全部移至PVDF膜。用丽春红S染PVDF膜2-5min，再使用去离子水漂洗至脱去颜色，最后鉴定转膜是否成功。5%脱脂奶粉室温封闭PVDF膜1h，一抗根据不同抗体说明书比例用1×TPBS溶液稀释，将膜加上对应的一抗，摇床上室温4℃孵育过夜，TPBS洗膜5次，每次5min，室温孵育二抗2h，TPBS洗膜4次，每次5min。用EZ-ECL试剂盒孵育1min，暗室中用X-射线感光胶片曝光，全自动胶片冲洗机冲洗胶片，蛋白条带用Epson扫描仪扫描，用Gelpro-32蛋白处理软件进行光密度分析。
统计学处理运用SPSS16.0统计学软件进行数据分析，各项结果全部用Mean土S.E.M.表示，多组数据进行比较可以采用方差进行分析，同时进行方差齐性检验，当P<0.05时符合统计学规定，具有统计学意义。
3 结果
3.1 小鼠膿毒症模型的建立，为证明是否造模成功
利用心包穿刺术抽取小鼠的血液样本进行了内毒素浓度的检测。结果显示，CLP模型组小鼠中的内毒素水平明显高于阴性对照组，数据统计结果也显示具有统计学意义。脓毒症小鼠出现了眼部周围充满脓性分泌物，常的躁动、甚至出现嗜睡、昏睡和昏迷。这些结果都显示，CLP模型符合脓毒性脑病的病理生理学的研究。
3.2 血脑屏障（BBB）关联蛋白的变化
我们检测了正常组与小鼠CLP模型组，BBB的相关蛋白（ZO-1，Claudin-5）在大脑皮层区的表达变化。结果显示与正常组相比，CLP造模组中，ZO-1与Claudin-5蛋白表达量上升，由此推测在脓毒症早期，血脑屏障被破坏。Fas及其配体Fas？L是诱导编程性死亡的细胞表面分子。Westen Blot结果显示在模型组中，Fas蛋白表达上升，Fas的配体Fas Ligind蛋白表达无变化。
3.4 金属蛋白酶MMP-9蛋白变化
结果显示，与阴性对照组相比，在模型组中金属蛋白酶MMP-9的蛋白表达上升。
4 结论与阴性对照组相比
脓毒症1h后，小鼠大脑皮层区的BBB的相关蛋白（ZO-1，Claudin-5），Fas及金属蛋白酶MMP-9蛋白表达上升，而Fas的配体Fas Ligind蛋白表达基本无变化。这些结果显示ZO-1，Claudin-5，Fas及金属蛋白酶MMP-9都可能参与到小鼠脓毒症的发病过程中。
参考文献
[1]Papadopoulos MC， Davies DC， Moss RF， Tighe D， Bennett ED. Pathophysiology of septic encephalopathy： a review. Crit Care Med. 2000；28（8）：3019-3024.
[2]Ginès P， Fernández J， Durand F， Saliba F. Management of critically-ill cirrhotic patients. J Hepatol. 2012；56 Suppl 1：S13-24.
[3]Gustot T， Durand F， Lebrec D， Vincent JL， Moreau R. Severe sepsis in cirrhosis. Hepatology. 2009；50（6）：2022-2033.
[4]Kathleen R， Melinda W M， Roxanne K， Sarah C P W. Focus on sepsis. Nat Med. 2012；18（7）：997-1002.
[5]Weberpals M， Hermes M， Hermann S， Kummer MP， Terwel D， Semmler A， Berger M， Sch？fers M， Heneka MT. NOS2 gene deficiency protects from sepsis-induced long-term cognitive deficits. J Neurosci. 2009；29（45）：14177-14184.
[6]Goodwin JE， Feng Y， Velazquez H， Sessa WC. Endothelial glucocorticoid receptor is required for protection against sepsis. Proc Natl Acad Sci USA. 2013；110（1）：306-311.
作者简介：弓淼（1993.12-），男，籍贯：陕西省榆林市，学历：本科，研究方向：生物工程.