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摘要：【目的】分析水稻親本籼粳分化程度与杂种优势的相关性，为研究双亲籼粳分化最佳配比及组配籼粳交强优势组合提供理论参考。【方法】采用ILP分子标记和程氏形态指数法对51份水稻亲本材料进行籼粳分化程度检测，基于23个ILP分子标记进行系统聚类分析，分析两种方法的相关性。按籼/籼、偏籼/偏籼、籼/偏籼、籼/偏粳、偏籼/偏粳和偏粳/偏粳6种类型配制150个杂交组合，综合分析亲本籼粳分化程度与杂种优势的相关性。【结果】采用程氏形态指数法从51份水稻亲本材料共检测出籼型20份、偏籼型19份、偏粳型6份和粳型6份;利用23对扩增结果稳定、条带清晰且只有两种等位基因的ILP引物从51份供试亲本材料中共检测出籼型14份、偏籼型20份、偏粳型11份和粳型6份，不存在100%纯籼或纯粳类型。ILP分子标记法与程氏形态指数法的籼粳分类结果均与系统聚类分析结果具有较高的吻合度，但仍在差异。51份供试亲本的粳稻成分指数与穗轴第1～2节长和抽穗时稃色呈显著正相关（P<0.05），与谷粒长宽比、酚反应和程氏指数总分呈极显著正相关（P<0.01），其中与程氏指数总分的相关系数最高，为0.81。随着组配双亲粳稻成分的增加，6种组配类型杂交组合的生育期、株高和每穗总粒数总体呈增加趋势，但单株有效穗数、结实率和千粒重总体呈下降趋势，单株重则呈先增加再下降的变化趋势。【结论】利用ILP分子标记可有效区分亲本的籼粳属性，是一种有效的水稻籼粳分类工具。采用籼/偏籼方式配组较易筛选到强优组合;虽然采用籼/偏粳方式配组获得高产组合的概率较低，但有机会获得极高产组合，在育种中亦可大胆尝试。
关键词： 水稻;亲本;籼粳分化;ILP分子标记;杂种优势
中图分类号： S511.033 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）05-0942-08
Abstract：【Objective】The correlation between indica-japonica differentiation and heterosis was studied to provide theoretical reference for the optimum ratio of indica-japonica differentiation in parents of indica-japonica rice and inter-subspecific hybrid rice combinations. 【Method】ILP molecular marker and Cheng’s morphology index were used to detect indica-japonica differentiation level of 51 rice parents. And the correlation between the two methods was clustered by 23 ILP molecular markers. A total of 150 hybrid combinations were set based on indica/indica， partial indica/partial indica， indica/partial indica， indica/partial japonica， partial indica/partial japonica and partial japonica/partial japonica， and correlation between indica-japonica differentiation and heterosis was analyzed. 【Result】There were 20 indica types，19 partial indica types，6 partial japonica types and 6 japonica types were detected from the 51 tested parents based on Cheng’s morphology index. Twenty-three pairs of ILP primers which had stable amplification products， clear bands and two alleles were used to detect 14 indica types，20 partial indica types，11 partial japonica types and 6 japonica types out of 51 tested parents. There was no 100% pure indica or japonica types. The indica-japonica differentiation results by ILP molecular marker and Cheng’s morphology index were highly consistent with clustering analysis but still different. Indica-japonica component index of 51 test parents was significantly positively correlated with length of the first and second rachis internode and glume color at heading stage（P<0.05）， and was extremely positively correlated with length-width ratio of grain， phenol reaction and Cheng’s index total score（P<0.01）. The correlation with Cheng’s index total score was the highest（0.81）. With the increase of parental japonica rice composition，the six types combinations all showed an overall increasing trend in growth period，plant height and total grain per panicle. But effective panicles per plant，seed-setting rate and 1000-grain weight decreased. The variation trend of single plant weight was firstly increased and then decreased. 【Conclusion】ILP molecular marker can be used to accurately detect the proportion of indica/japonica content in rice parent. It is an easy tool to classify indica and japonica rice. Fine combinations can be easily obtained through indica/partial indica combination. It is possible to obtain extremely high-yield combinations through indica/partial japonica，although the probability of obtaining high-yield combinations is low. It is worth trying in breeding. Key words： rice; parents; indica-japonica differentiation; ILP molecular marker; heterosis
0 引言
【研究意义】籼稻和粳稻是亚洲栽培稻的两个亚种，因其杂交后代可产生丰富变异，蕴藏着巨大杂种优势（袁隆平等，1997;孙传清等，2000;Li et al.，2000），因此通过综合两大亚种优势进行籼粳杂交育种是进一步提高水稻产量的有效途径，逐渐成为研究热点（况浩池等，2007;陈芬等，2009;郑秀娟等，2016）。然而，由于籼稻与粳稻在分类学上属于不同的亚种，亲缘关系较远，导致杂种一代存在结实率低、植株过高、生育期偏长和籽粒充实不饱满等问题，无法直接利用。随着广亲和基因的发现，研究人员开始利用籼粳交培育优良杂交稻亲本，目前已育成大量籼粳交水稻亲本，但主要建立在随机配组的基础上（马彬林，2015），导致选育效率较低。因此，研究配组双亲籼粳分化程度与杂种优势间的相关性对选育综合性状优良的籼粳交衍生系（不育系或恢复系）具有重要意义。【前人研究进展】在籼粳交杂种优势利用过程中，籼粳分化最佳配比引起普遍关注，主要从籼粳交新品种选育、不同生态条件下籼粳亚种特性、籼粳分化分子检测、籼粳分化程度与杂种优势关系等方面开展相关研究，并取得了长足的进展。姜廷波等（1999）分别用45个籼粳特异性RFLP分子标记和形态指数分类法分析供试亲本及杂种的籼粳分化程度，结果表明两种分类方法均可将亲本和杂种分为籼和粳两大类群。龙雯虹等（2003）以10个滇型杂交稻不育系及其相应的10个保持系和38个恢复系、不育系和恢复系组配的40个杂交种为试材，研究亲本材料的籼粳分化程度与杂种优势的相关性，结果表明亲本籼粳差异与产量杂种优势呈抛物线的关系。张建勇等（2005）利用126个SSR分子标记对42份常用杂交水稻亲本材料进行籼粳分类研究，结果表明聚类结果与亲本材料亲缘关系基本吻合，说明SSR分子标记能较好地区分籼稻和粳稻。姜树坤等（2006）用18个RAPD分子标记对30个水稻栽培品种进行籼粳分类研究，结果表明分类结果与品种系谱基本吻合，证明RAPD分子标记可应用于水稻的籼粳分类。张受刚和许旭明（2006）通过聚合不同广亲和基因对粳型亲籼恢复材料进行改良，选育出具有良好亲籼性和恢复能力的粳型亲籼恢复材料gk729，在此基础上进一步选育出具有良好亲籼性和恢复能力的粳型亲籼恢复材料gk419，最终育成一批综合性状优良的粳型亲籼恢复系，并应用于生产。徐海等（2007）以中优早8号×丰锦F6重组自交系群体为试材，在辽宁和四川两个生态区种植研究亚种特性的变化，结果表明，重组自交系群体在两个生态区均呈偏粳分布，且亚种特性均发生明显变化，总体表现为四川比辽宁更偏粳。许旭明等（2009）利用ILP分子标记和程氏形态指数法对18个籼粳杂交亲本和39个衍生系进行籼粳分化研究，结果表明ILP分子标记可准确检测籼（粳）成分比例，且籼粳分化可合理解释籼粳型恢复系配组杂交稻表现出明显杂种优势的原因。王明军等（2010）利用34对InDel分子标记将云南省各地的181份糯稻材料划分为141份典型籼稻、18份籼稻、8份典型粳稻、13份粳稻和1份偏粳稻。黄明（2010）研究发现，ILP分子标记具有很强的籼粳特异性，且绝大多数只扩增出两种条带，具有很大的利用价值，可预测常规杂交稻产量的杂种优势。李亚莉等（2012）利用SSR分子标记分析滇型杂交稻亲本籼粳分化程度与杂种优势的相关性，结果发现亲本籼粳分化差异与产量竞争优势无线性关系。范方军等（2015）利用32对InDel分子标记和18对SSR分子标记将200份太湖流域水稻地方材料划分为179份典型粳稻、17份典型籼稻、籼稻2份及粳稻和偏粳稻各1份。综上所述，利用分子标记可有效对水稻进行籼粳分类及杂种优势预测，尤其是ILP分子标记具有很强籼粳特异性，在杂种优势预测方面具有很大的利用价值。【本研究切入点】前人研究多集中在利用分子标记进行籼粳分类，但籼粳分化程度与杂种优势间的相关性研究甚少，尤其鲜见利用ILP分子标记进行两系亲本籼粳分化程度与杂种优势间相关性的研究报道。【拟解决的关键问题】利用ILP分子标记检测历时十余载培育而成的籼粳交龙恢系列恢复系和福龙S系列不育系共51份亲本材料的籼粳分化程度，探索双亲籼粳分化程度与杂种优势间的相关性，以期明晰龙恢系列恢复系和福龙S系列不育系的籼粳分化情况，为研究双亲籼粳分化最佳配比及组配籼粳交强优势组合提供理论参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试水稻材料为9311、蜀恢527、多系一号、明恢70、日本晴、武运粳7号、武运粳27号、镇稻413、盐粳48、武育粳3号、奥龙1S、12个福龙S系列不育系及28个龙恢系列恢复系。以上述材料为亲本配制的150个杂交组合由福建省龙岩市农业科学研究所提供。23对ILP分子标记引物（表1）由福建省三明市农业科学院提供，由生工生物工程（上海）股分服务有限公司合成。主要试剂：核酸染料（Ultra GelRed）购自南京诺唯赞生物科技有限公司，2×Taq PCR Master Mix购自北京艾德莱生物科技有限公司，其他试剂均购自福州沃森生物技术有限公司。主要仪器：人工气候箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、Veriti梯度PCR仪（ABI，美国）、SCIENTIFIC电泳仪（C.B.S，美国）和Sigma3-30KS高速冷冻离心机（Sigma，德国）。
1. 2 試验方法
1. 2. 1 亲本籼粳分化程度检测
1. 2. 1. 1 程氏形态指数法 采用程侃声（1993）的程氏形态指数法，分别对稃毛、叶毛、抽穗时的壳色、籽粒长宽比、第1～2穗节长和酚反应等6个性状进行评分，各性状得分之和为程氏指数总分，以其作为分类尺度：指数值0～8分为籼型，9～13分为偏籼型，14～17分为偏粳型，18～24分为粳型。 1. 2. 1. 2 ILP标记法 采用SDS法提取DNA，将其用于PCR扩增。PCR反应体系15.00 ?L：DNA模板2.00 ?L，10 mmol/L Mg2+ 10×缓冲液0.75 ?L，10×Buffer 1.25 ?L，2.5 mmol/L dNTP 0.30 ?L，50 ng/?L上、下游引物1.50 ?L，5 U/?L Taq Plus DNA聚合酶0.15 ?L，ddH2O补足至15.00 ?L。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s;72 ℃ 1.0 min，进行10个循环;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行10个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR产物中加入3.0 ?L上样缓冲液，上样量3.0 ?L，在SCIENTIFIC电泳仪上进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。凝胶成分包括0.04%过硫酸铵、0.1% TEMED和10%丙烯酰胺，电泳缓冲液为0.5×TBE，250 V电泳1.5 h。银染法染色，定影。薄膜包好置于室温干燥后统计条带并照相。
1. 2. 2 农艺性状考察 2018年春季在海南省三亚市藤桥镇南繁基地，从14个籼型亲本中选出5个不育系（福龙S3、福龙S5、福龙S16、福龙S7和奥龙1S）和5个恢复系（龙恢5928、蜀恢527、龙恢109、龙恢3381和9311），从20个偏籼型亲本中选出5个不育系（福龙S8、福龙S9、福龙S2、福龙S19和福龙S12）和5个恢复系（龙恢1031、龙恢3389、龙恢20、龙恢236和龙恢29），从11个偏粳型亲本中选出10个恢复系（用作母本：龙恢536、龙恢479、龙恢557、龙恢438、龙恢6315;用作父本：龙恢517、龙恢66、龙恢336、龙恢8612、龙恢779），共计30个亲本。按籼/籼、偏籼/偏籼、偏粳/偏粳、籼/偏籼、籼/偏粳和偏籼/偏粳6种组配类型进行5×5不完全双列测交（杂交），共配制150個杂交组合。2018年秋季在福建省龙岩市新罗区龙门镇赤水村育种基地，采用随机区组设计，3次重复，每小区单本种植32株，成熟时及时收获并按照左生力（2016）的方法考察150个组合的生育期、株高及产量相关性状（单株有效穗、每穗总粒、结实率、千粒重和单株重）。
1. 3 统计分析
人工统计所有清晰可辨的电泳条带。同一引物按扩增条带的“有”或“无”计数，迁移率相同的条带视为1个位点，有条带赋值为1，无条带赋值为0，从而建立特征数据矩阵用于进一步分析。按Xi =∑Xd/（∑Xd+∑Jd），Xj =∑Jd/（∑Xd+∑Jd）公式计算籼粳成分指数，其中，Xi为籼稻成分指数（Composition index of indica rice），Xj为粳稻成分指数（Composition index of japonica rice），Xd为籼稻条带，Jd为粳稻条带，以成分指数计算各供试亲本的籼粳分化程度。根据许旭明等（2009）的划分标准，将粳稻成分指数≥50%的材料判定为粳型，18.0%～49.9%为偏粳型，8.0%～17.9%为偏籼型，<8.0%为籼型。
2 结果与分析
2. 1 引物筛选及供试亲本扩增结果
用程氏形态指数法划分供试亲本的籼粳类型，选出籼型和粳型两种类型作为多态性条带籼粳属性判别依据，对许旭明等（2009）的48对ILP引物作进一步筛选，最终获得23对扩增结果稳定、条带清晰且只有两种等位基因的ILP引物，利用其对51份水稻亲本材料进行PCR扩增，结果显示，每对引物均检测到2种等位基因条带，23对ILP引物共扩增到46条条带（图1）。
2. 2 供试亲本籼粳分类及聚类分析结果
2. 2. 1 程氏形态指数法 采用程氏形态指数法对51份水稻亲本材料进行籼粳类型划分，结果如表2所示。从51份水稻亲本材料共检测出籼型20份、偏籼型19份、偏粳型6份和粳型6份。
2. 2. 2 ILP分子标记法 由表3可知，51份水稻亲本材料基因组DNA在所检测位点上均存在籼粳分化，不存在100%纯籼或纯粳类型，共检测出籼型14份、偏籼型20份、偏粳型11份和粳型6份，平均粳稻成分指数分别为4.35%、11.21%、34.39%和68.70%。
基于23个ILP分子标记的系统聚类分析结果如图2所示。当阀值为0.67时，51份水稻亲本材料可分为Ⅰ和Ⅱ两个大类，Ⅰ类为粳型（6份），Ⅱ类为其他类型（45份）;Ⅱ类在阀值为0.37时可进一步分为Ⅱa和Ⅱb 2个亚类，Ⅱa亚类为偏粳型（11份），Ⅱb亚类为其他类型（34份）;Ⅱb亚类在阀值为0.15时又可划分为Ⅱb-1和Ⅱb-2，分别为籼型（21份）和偏籼型（13份）。
综上所述，利用ILP分子标记能有效区分供试亲本的籼粳属性，其分类结果和程氏形态指数分类结果均与系统聚类分析结果具有较高的吻合度，是一种有效的水稻籼粳分类工具。
2. 2. 3 ILP分子标记法与程氏形态指数法间的相关性分析 为进一步明晰ILP分子标记法与程氏形态指数法间的相关性，本研究将粳稻成分指数分别与谷粒长宽比、穗轴第1～2节长、抽穗时稃色、酚反应、稃毛、叶毛和程氏指数总分进行相关性分析，结果（表4）显示，51个供试亲本的粳稻成分指数与穗轴第1～2节长和抽穗时稃色呈显著正相关（P<0.05），与谷粒长宽比、酚反应和程氏指数总分呈极显著正相关（P<0.01），其中与程氏指数总分的相关系数最高，为0.81，表明ILP分子标记法与程氏形态指数法间具有较高的吻合度，采用ILP分子标记可有效鉴别水稻亲本的籼粳类型。
2. 3 亲本籼粳分化程度与杂种优势的相关性
根据ILP分子标记法的籼粳分类结果（表5），按籼/籼、籼/偏籼、偏籼/偏籼、籼/偏粳、偏籼/偏粳和偏粳/偏粳6种类型配制150个杂交组合，其生育期、株高及产量相关性状如表5所示。随着组配双亲粳稻成分的增加，杂交组合的生育期、株高和每穗总粒数总体呈增加趋势，但单株有效穗数、结实率和千粒重总体呈下降趋势。籼/籼组配类型的生育期、株高和单株有效穗数较理想，较易选配出生育期短、株高较矮且多穗型的组合;籼/偏籼组配类型在各性状上均有较好的表现，尤其在单株重这一综合指标上表现最佳，较易选配出强优组合;籼/偏粳组配类型的每穗总粒数较高且方差最大，较易选配出大穗型组合。6种组配类型的单株重排序为籼/偏籼>偏籼/偏籼>籼/籼>籼/偏粳>偏籼/偏粳>偏粳/偏粳，对应的各类型中单株重在40.0 g以上的组合数分别为8、6、5、2、0和0个，随着组配双亲粳稻成分的增加，单株重呈出先增加后下降的变化趋势，推测获得高产组合的概率也呈类似变化趋势。虽然籼/偏粳组配类型获得高产组合的概率比籼/籼、籼/偏籼和偏籼/偏籼3种组配类型低，但实际测量结果显示，150个杂交组合中单株重最重的组合为福龙S16×龙恢336，为46.8 g，表明籼/偏粳组配类型仍有机会获得极高产组合，育种中亦可大胆尝试。 3 讨论
3. 1 ILP分子标记检测水稻籼粳分化程度
本研究中ILP分子标记法与程氏形态指数法间的相关性分析结果显示，51份供试亲本材料的粳稻成分指数与穗轴第1～2节长和抽穗时稃色呈显著正相关，与谷粒长宽比、酚反应和程氏指数总分呈极显著正相关，其中与程氏指数总分的相关系数最高，为0.81，表明ILP分子标记法与程氏形态指数法间具有较高的吻合度，采用ILP分子标记可有效鉴别供试亲本的籼粳类型，与许旭明等（2009）、陈惠清等（2016）的研究结果相同。本研究还与杨旺兴等（2013）的研究报道相似，如供试亲本外观形态上属于籼型的龙恢479、龙恢336、福龙S2和龙恢29，其粳稻成分指数分别为30.43%、34.78%、13.04%和17.39，說明前两者属于偏粳型，后两者属于偏籼型，表明偏籼、偏粳等中间类型介于籼型与粳型之间，兼具籼稻与粳稻的特征特性，较难区分。这一现象可很好地解释福龙S2所配组合选育出的品种如福龙两优29和福龙两优6387等生产上的强优势表现，其原因是所配组合较好地利用了部分籼粳杂种优势。
此外，本研究中水稻品种9311的粳稻成分指数为8.70%，根据许旭明等（2009）的划分标准，应划为偏籼型。但据许旭明等（2009）的研究结果显示，9311粳稻成分指数4.17%，应划为籼型。两者存在差异的原因主要有两个方面：一是使用的ILP分子标记不同导致检测的粳稻成分指数存在差异;二是划分标准不够准确和完善，有待进一步优化。这也是导致本研究中籼粳分类结果和系统聚类分析结果存在差异的原因。
3. 2 亲本籼粳分化程度与杂种优势的关系
本研究发现，随着组配双亲粳稻成分的增加，籼/籼、偏籼/偏籼、籼/偏籼、偏粳/偏粳、籼/偏粳和偏籼/偏粳6种类型组配杂交组合的生育期、株高和每穗总粒数总体呈增加趋势，而单株有效穗数、结实率和千粒重总体呈下降趋势，且这些变化趋势在籼/籼、籼/偏籼、籼/偏粳组配类型更加明显。除生育期和结实率外，上述结果与马彬林（2015）的研究结果基本相同。在结实率方面，随着籼/籼、籼/偏籼和籼/偏粳组配类型双亲间粳稻成分指数差值的增加，结实率呈明显下降趋势，与陈惠清等（2016）的研究结果一致。
关于亲本籼粳分化程度与产量杂种优势间的相关性已有大量研究，但其结果因供试材料不同而各异（黄明，2010;李亚莉等，2012）。本研究发现，当不育系同为籼型时，籼/籼、籼/偏籼和籼/偏粳3种组配类型双亲间的粳稻成分指数差值逐渐增大，杂种优势先增强后减弱，且对应的各类组合中单株重在40.0 g以上的组合数分别为5、6和8个，当恢复系为偏籼类型时较易选配出强优组合，与龙雯虹等（2003）的观点相似。另外，本研究结果显示，虽然采用籼/偏粳方式配组获得高产组合的概率较低，但有机会获得极高产组合。通过进一步分析各杂交组合双亲粳稻成分指数发现，在150个杂交组合中，单株重最重的组合为福龙S16×龙恢336，为46.8 g，其父本粳稻成分指数和母本粳稻成分指数的差值为30.43%，福龙S16×龙恢66组合的父本粳稻成分指数和母本粳稻成分指数的差值也为30.43%，但其平均单株重仅为33.6 g，以上两个组合的双亲粳稻成分差值均未在籼/偏籼组配类型的差值范围（4.35%～13.04%）内，该现象值得进一步深入研究。
4 结论
利用ILP分子标记可有效区分供试亲本的籼粳属性，是一种有效的水稻籼粳分类工具。采用籼/偏籼方式配组较易筛选到强优组合;虽然采用籼/偏粳方式配组获得高产组合的概率较低，但有机会获得极高产组合。
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（责任编辑 陈 燕）
关键词： 水稻;亲本;籼粳分化;ILP分子标记;杂种优势
中图分类号： S511.033 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2019）05-0942-08
Abstract：【Objective】The correlation between indica-japonica differentiation and heterosis was studied to provide theoretical reference for the optimum ratio of indica-japonica differentiation in parents of indica-japonica rice and inter-subspecific hybrid rice combinations. 【Method】ILP molecular marker and Cheng’s morphology index were used to detect indica-japonica differentiation level of 51 rice parents. And the correlation between the two methods was clustered by 23 ILP molecular markers. A total of 150 hybrid combinations were set based on indica/indica， partial indica/partial indica， indica/partial indica， indica/partial japonica， partial indica/partial japonica and partial japonica/partial japonica， and correlation between indica-japonica differentiation and heterosis was analyzed. 【Result】There were 20 indica types，19 partial indica types，6 partial japonica types and 6 japonica types were detected from the 51 tested parents based on Cheng’s morphology index. Twenty-three pairs of ILP primers which had stable amplification products， clear bands and two alleles were used to detect 14 indica types，20 partial indica types，11 partial japonica types and 6 japonica types out of 51 tested parents. There was no 100% pure indica or japonica types. The indica-japonica differentiation results by ILP molecular marker and Cheng’s morphology index were highly consistent with clustering analysis but still different. Indica-japonica component index of 51 test parents was significantly positively correlated with length of the first and second rachis internode and glume color at heading stage（P<0.05）， and was extremely positively correlated with length-width ratio of grain， phenol reaction and Cheng’s index total score（P<0.01）. The correlation with Cheng’s index total score was the highest（0.81）. With the increase of parental japonica rice composition，the six types combinations all showed an overall increasing trend in growth period，plant height and total grain per panicle. But effective panicles per plant，seed-setting rate and 1000-grain weight decreased. The variation trend of single plant weight was firstly increased and then decreased. 【Conclusion】ILP molecular marker can be used to accurately detect the proportion of indica/japonica content in rice parent. It is an easy tool to classify indica and japonica rice. Fine combinations can be easily obtained through indica/partial indica combination. It is possible to obtain extremely high-yield combinations through indica/partial japonica，although the probability of obtaining high-yield combinations is low. It is worth trying in breeding. Key words： rice; parents; indica-japonica differentiation; ILP molecular marker; heterosis
0 引言
【研究意义】籼稻和粳稻是亚洲栽培稻的两个亚种，因其杂交后代可产生丰富变异，蕴藏着巨大杂种优势（袁隆平等，1997;孙传清等，2000;Li et al.，2000），因此通过综合两大亚种优势进行籼粳杂交育种是进一步提高水稻产量的有效途径，逐渐成为研究热点（况浩池等，2007;陈芬等，2009;郑秀娟等，2016）。然而，由于籼稻与粳稻在分类学上属于不同的亚种，亲缘关系较远，导致杂种一代存在结实率低、植株过高、生育期偏长和籽粒充实不饱满等问题，无法直接利用。随着广亲和基因的发现，研究人员开始利用籼粳交培育优良杂交稻亲本，目前已育成大量籼粳交水稻亲本，但主要建立在随机配组的基础上（马彬林，2015），导致选育效率较低。因此，研究配组双亲籼粳分化程度与杂种优势间的相关性对选育综合性状优良的籼粳交衍生系（不育系或恢复系）具有重要意义。【前人研究进展】在籼粳交杂种优势利用过程中，籼粳分化最佳配比引起普遍关注，主要从籼粳交新品种选育、不同生态条件下籼粳亚种特性、籼粳分化分子检测、籼粳分化程度与杂种优势关系等方面开展相关研究，并取得了长足的进展。姜廷波等（1999）分别用45个籼粳特异性RFLP分子标记和形态指数分类法分析供试亲本及杂种的籼粳分化程度，结果表明两种分类方法均可将亲本和杂种分为籼和粳两大类群。龙雯虹等（2003）以10个滇型杂交稻不育系及其相应的10个保持系和38个恢复系、不育系和恢复系组配的40个杂交种为试材，研究亲本材料的籼粳分化程度与杂种优势的相关性，结果表明亲本籼粳差异与产量杂种优势呈抛物线的关系。张建勇等（2005）利用126个SSR分子标记对42份常用杂交水稻亲本材料进行籼粳分类研究，结果表明聚类结果与亲本材料亲缘关系基本吻合，说明SSR分子标记能较好地区分籼稻和粳稻。姜树坤等（2006）用18个RAPD分子标记对30个水稻栽培品种进行籼粳分类研究，结果表明分类结果与品种系谱基本吻合，证明RAPD分子标记可应用于水稻的籼粳分类。张受刚和许旭明（2006）通过聚合不同广亲和基因对粳型亲籼恢复材料进行改良，选育出具有良好亲籼性和恢复能力的粳型亲籼恢复材料gk729，在此基础上进一步选育出具有良好亲籼性和恢复能力的粳型亲籼恢复材料gk419，最终育成一批综合性状优良的粳型亲籼恢复系，并应用于生产。徐海等（2007）以中优早8号×丰锦F6重组自交系群体为试材，在辽宁和四川两个生态区种植研究亚种特性的变化，结果表明，重组自交系群体在两个生态区均呈偏粳分布，且亚种特性均发生明显变化，总体表现为四川比辽宁更偏粳。许旭明等（2009）利用ILP分子标记和程氏形态指数法对18个籼粳杂交亲本和39个衍生系进行籼粳分化研究，结果表明ILP分子标记可准确检测籼（粳）成分比例，且籼粳分化可合理解释籼粳型恢复系配组杂交稻表现出明显杂种优势的原因。王明军等（2010）利用34对InDel分子标记将云南省各地的181份糯稻材料划分为141份典型籼稻、18份籼稻、8份典型粳稻、13份粳稻和1份偏粳稻。黄明（2010）研究发现，ILP分子标记具有很强的籼粳特异性，且绝大多数只扩增出两种条带，具有很大的利用价值，可预测常规杂交稻产量的杂种优势。李亚莉等（2012）利用SSR分子标记分析滇型杂交稻亲本籼粳分化程度与杂种优势的相关性，结果发现亲本籼粳分化差异与产量竞争优势无线性关系。范方军等（2015）利用32对InDel分子标记和18对SSR分子标记将200份太湖流域水稻地方材料划分为179份典型粳稻、17份典型籼稻、籼稻2份及粳稻和偏粳稻各1份。综上所述，利用分子标记可有效对水稻进行籼粳分类及杂种优势预测，尤其是ILP分子标记具有很强籼粳特异性，在杂种优势预测方面具有很大的利用价值。【本研究切入点】前人研究多集中在利用分子标记进行籼粳分类，但籼粳分化程度与杂种优势间的相关性研究甚少，尤其鲜见利用ILP分子标记进行两系亲本籼粳分化程度与杂种优势间相关性的研究报道。【拟解决的关键问题】利用ILP分子标记检测历时十余载培育而成的籼粳交龙恢系列恢复系和福龙S系列不育系共51份亲本材料的籼粳分化程度，探索双亲籼粳分化程度与杂种优势间的相关性，以期明晰龙恢系列恢复系和福龙S系列不育系的籼粳分化情况，为研究双亲籼粳分化最佳配比及组配籼粳交强优势组合提供理论参考。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试水稻材料为9311、蜀恢527、多系一号、明恢70、日本晴、武运粳7号、武运粳27号、镇稻413、盐粳48、武育粳3号、奥龙1S、12个福龙S系列不育系及28个龙恢系列恢复系。以上述材料为亲本配制的150个杂交组合由福建省龙岩市农业科学研究所提供。23对ILP分子标记引物（表1）由福建省三明市农业科学院提供，由生工生物工程（上海）股分服务有限公司合成。主要试剂：核酸染料（Ultra GelRed）购自南京诺唯赞生物科技有限公司，2×Taq PCR Master Mix购自北京艾德莱生物科技有限公司，其他试剂均购自福州沃森生物技术有限公司。主要仪器：人工气候箱（上海博迅医疗生物仪器股份有限公司）、Veriti梯度PCR仪（ABI，美国）、SCIENTIFIC电泳仪（C.B.S，美国）和Sigma3-30KS高速冷冻离心机（Sigma，德国）。
1. 2 試验方法
1. 2. 1 亲本籼粳分化程度检测
1. 2. 1. 1 程氏形态指数法 采用程侃声（1993）的程氏形态指数法，分别对稃毛、叶毛、抽穗时的壳色、籽粒长宽比、第1～2穗节长和酚反应等6个性状进行评分，各性状得分之和为程氏指数总分，以其作为分类尺度：指数值0～8分为籼型，9～13分为偏籼型，14～17分为偏粳型，18～24分为粳型。 1. 2. 1. 2 ILP标记法 采用SDS法提取DNA，将其用于PCR扩增。PCR反应体系15.00 ?L：DNA模板2.00 ?L，10 mmol/L Mg2+ 10×缓冲液0.75 ?L，10×Buffer 1.25 ?L，2.5 mmol/L dNTP 0.30 ?L，50 ng/?L上、下游引物1.50 ?L，5 U/?L Taq Plus DNA聚合酶0.15 ?L，ddH2O补足至15.00 ?L。PCR扩增程序：94 ℃预变性5 min;94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s;72 ℃ 1.0 min，进行10个循环;94 ℃ 30 s，56 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，进行10个循环;72 ℃延伸5 min，4 ℃保存。PCR产物中加入3.0 ?L上样缓冲液，上样量3.0 ?L，在SCIENTIFIC电泳仪上进行非变性聚丙烯酰胺凝胶电泳分离。凝胶成分包括0.04%过硫酸铵、0.1% TEMED和10%丙烯酰胺，电泳缓冲液为0.5×TBE，250 V电泳1.5 h。银染法染色，定影。薄膜包好置于室温干燥后统计条带并照相。
1. 2. 2 农艺性状考察 2018年春季在海南省三亚市藤桥镇南繁基地，从14个籼型亲本中选出5个不育系（福龙S3、福龙S5、福龙S16、福龙S7和奥龙1S）和5个恢复系（龙恢5928、蜀恢527、龙恢109、龙恢3381和9311），从20个偏籼型亲本中选出5个不育系（福龙S8、福龙S9、福龙S2、福龙S19和福龙S12）和5个恢复系（龙恢1031、龙恢3389、龙恢20、龙恢236和龙恢29），从11个偏粳型亲本中选出10个恢复系（用作母本：龙恢536、龙恢479、龙恢557、龙恢438、龙恢6315;用作父本：龙恢517、龙恢66、龙恢336、龙恢8612、龙恢779），共计30个亲本。按籼/籼、偏籼/偏籼、偏粳/偏粳、籼/偏籼、籼/偏粳和偏籼/偏粳6种组配类型进行5×5不完全双列测交（杂交），共配制150個杂交组合。2018年秋季在福建省龙岩市新罗区龙门镇赤水村育种基地，采用随机区组设计，3次重复，每小区单本种植32株，成熟时及时收获并按照左生力（2016）的方法考察150个组合的生育期、株高及产量相关性状（单株有效穗、每穗总粒、结实率、千粒重和单株重）。
1. 3 统计分析
人工统计所有清晰可辨的电泳条带。同一引物按扩增条带的“有”或“无”计数，迁移率相同的条带视为1个位点，有条带赋值为1，无条带赋值为0，从而建立特征数据矩阵用于进一步分析。按Xi =∑Xd/（∑Xd+∑Jd），Xj =∑Jd/（∑Xd+∑Jd）公式计算籼粳成分指数，其中，Xi为籼稻成分指数（Composition index of indica rice），Xj为粳稻成分指数（Composition index of japonica rice），Xd为籼稻条带，Jd为粳稻条带，以成分指数计算各供试亲本的籼粳分化程度。根据许旭明等（2009）的划分标准，将粳稻成分指数≥50%的材料判定为粳型，18.0%～49.9%为偏粳型，8.0%～17.9%为偏籼型，<8.0%为籼型。
2 结果与分析
2. 1 引物筛选及供试亲本扩增结果
用程氏形态指数法划分供试亲本的籼粳类型，选出籼型和粳型两种类型作为多态性条带籼粳属性判别依据，对许旭明等（2009）的48对ILP引物作进一步筛选，最终获得23对扩增结果稳定、条带清晰且只有两种等位基因的ILP引物，利用其对51份水稻亲本材料进行PCR扩增，结果显示，每对引物均检测到2种等位基因条带，23对ILP引物共扩增到46条条带（图1）。
2. 2 供试亲本籼粳分类及聚类分析结果
2. 2. 1 程氏形态指数法 采用程氏形态指数法对51份水稻亲本材料进行籼粳类型划分，结果如表2所示。从51份水稻亲本材料共检测出籼型20份、偏籼型19份、偏粳型6份和粳型6份。
2. 2. 2 ILP分子标记法 由表3可知，51份水稻亲本材料基因组DNA在所检测位点上均存在籼粳分化，不存在100%纯籼或纯粳类型，共检测出籼型14份、偏籼型20份、偏粳型11份和粳型6份，平均粳稻成分指数分别为4.35%、11.21%、34.39%和68.70%。
基于23个ILP分子标记的系统聚类分析结果如图2所示。当阀值为0.67时，51份水稻亲本材料可分为Ⅰ和Ⅱ两个大类，Ⅰ类为粳型（6份），Ⅱ类为其他类型（45份）;Ⅱ类在阀值为0.37时可进一步分为Ⅱa和Ⅱb 2个亚类，Ⅱa亚类为偏粳型（11份），Ⅱb亚类为其他类型（34份）;Ⅱb亚类在阀值为0.15时又可划分为Ⅱb-1和Ⅱb-2，分别为籼型（21份）和偏籼型（13份）。
综上所述，利用ILP分子标记能有效区分供试亲本的籼粳属性，其分类结果和程氏形态指数分类结果均与系统聚类分析结果具有较高的吻合度，是一种有效的水稻籼粳分类工具。
2. 2. 3 ILP分子标记法与程氏形态指数法间的相关性分析 为进一步明晰ILP分子标记法与程氏形态指数法间的相关性，本研究将粳稻成分指数分别与谷粒长宽比、穗轴第1～2节长、抽穗时稃色、酚反应、稃毛、叶毛和程氏指数总分进行相关性分析，结果（表4）显示，51个供试亲本的粳稻成分指数与穗轴第1～2节长和抽穗时稃色呈显著正相关（P<0.05），与谷粒长宽比、酚反应和程氏指数总分呈极显著正相关（P<0.01），其中与程氏指数总分的相关系数最高，为0.81，表明ILP分子标记法与程氏形态指数法间具有较高的吻合度，采用ILP分子标记可有效鉴别水稻亲本的籼粳类型。
2. 3 亲本籼粳分化程度与杂种优势的相关性
根据ILP分子标记法的籼粳分类结果（表5），按籼/籼、籼/偏籼、偏籼/偏籼、籼/偏粳、偏籼/偏粳和偏粳/偏粳6种类型配制150个杂交组合，其生育期、株高及产量相关性状如表5所示。随着组配双亲粳稻成分的增加，杂交组合的生育期、株高和每穗总粒数总体呈增加趋势，但单株有效穗数、结实率和千粒重总体呈下降趋势。籼/籼组配类型的生育期、株高和单株有效穗数较理想，较易选配出生育期短、株高较矮且多穗型的组合;籼/偏籼组配类型在各性状上均有较好的表现，尤其在单株重这一综合指标上表现最佳，较易选配出强优组合;籼/偏粳组配类型的每穗总粒数较高且方差最大，较易选配出大穗型组合。6种组配类型的单株重排序为籼/偏籼>偏籼/偏籼>籼/籼>籼/偏粳>偏籼/偏粳>偏粳/偏粳，对应的各类型中单株重在40.0 g以上的组合数分别为8、6、5、2、0和0个，随着组配双亲粳稻成分的增加，单株重呈出先增加后下降的变化趋势，推测获得高产组合的概率也呈类似变化趋势。虽然籼/偏粳组配类型获得高产组合的概率比籼/籼、籼/偏籼和偏籼/偏籼3种组配类型低，但实际测量结果显示，150个杂交组合中单株重最重的组合为福龙S16×龙恢336，为46.8 g，表明籼/偏粳组配类型仍有机会获得极高产组合，育种中亦可大胆尝试。 3 讨论
3. 1 ILP分子标记检测水稻籼粳分化程度
本研究中ILP分子标记法与程氏形态指数法间的相关性分析结果显示，51份供试亲本材料的粳稻成分指数与穗轴第1～2节长和抽穗时稃色呈显著正相关，与谷粒长宽比、酚反应和程氏指数总分呈极显著正相关，其中与程氏指数总分的相关系数最高，为0.81，表明ILP分子标记法与程氏形态指数法间具有较高的吻合度，采用ILP分子标记可有效鉴别供试亲本的籼粳类型，与许旭明等（2009）、陈惠清等（2016）的研究结果相同。本研究还与杨旺兴等（2013）的研究报道相似，如供试亲本外观形态上属于籼型的龙恢479、龙恢336、福龙S2和龙恢29，其粳稻成分指数分别为30.43%、34.78%、13.04%和17.39，說明前两者属于偏粳型，后两者属于偏籼型，表明偏籼、偏粳等中间类型介于籼型与粳型之间，兼具籼稻与粳稻的特征特性，较难区分。这一现象可很好地解释福龙S2所配组合选育出的品种如福龙两优29和福龙两优6387等生产上的强优势表现，其原因是所配组合较好地利用了部分籼粳杂种优势。
此外，本研究中水稻品种9311的粳稻成分指数为8.70%，根据许旭明等（2009）的划分标准，应划为偏籼型。但据许旭明等（2009）的研究结果显示，9311粳稻成分指数4.17%，应划为籼型。两者存在差异的原因主要有两个方面：一是使用的ILP分子标记不同导致检测的粳稻成分指数存在差异;二是划分标准不够准确和完善，有待进一步优化。这也是导致本研究中籼粳分类结果和系统聚类分析结果存在差异的原因。
3. 2 亲本籼粳分化程度与杂种优势的关系
本研究发现，随着组配双亲粳稻成分的增加，籼/籼、偏籼/偏籼、籼/偏籼、偏粳/偏粳、籼/偏粳和偏籼/偏粳6种类型组配杂交组合的生育期、株高和每穗总粒数总体呈增加趋势，而单株有效穗数、结实率和千粒重总体呈下降趋势，且这些变化趋势在籼/籼、籼/偏籼、籼/偏粳组配类型更加明显。除生育期和结实率外，上述结果与马彬林（2015）的研究结果基本相同。在结实率方面，随着籼/籼、籼/偏籼和籼/偏粳组配类型双亲间粳稻成分指数差值的增加，结实率呈明显下降趋势，与陈惠清等（2016）的研究结果一致。
关于亲本籼粳分化程度与产量杂种优势间的相关性已有大量研究，但其结果因供试材料不同而各异（黄明，2010;李亚莉等，2012）。本研究发现，当不育系同为籼型时，籼/籼、籼/偏籼和籼/偏粳3种组配类型双亲间的粳稻成分指数差值逐渐增大，杂种优势先增强后减弱，且对应的各类组合中单株重在40.0 g以上的组合数分别为5、6和8个，当恢复系为偏籼类型时较易选配出强优组合，与龙雯虹等（2003）的观点相似。另外，本研究结果显示，虽然采用籼/偏粳方式配组获得高产组合的概率较低，但有机会获得极高产组合。通过进一步分析各杂交组合双亲粳稻成分指数发现，在150个杂交组合中，单株重最重的组合为福龙S16×龙恢336，为46.8 g，其父本粳稻成分指数和母本粳稻成分指数的差值为30.43%，福龙S16×龙恢66组合的父本粳稻成分指数和母本粳稻成分指数的差值也为30.43%，但其平均单株重仅为33.6 g，以上两个组合的双亲粳稻成分差值均未在籼/偏籼组配类型的差值范围（4.35%～13.04%）内，该现象值得进一步深入研究。
4 结论
利用ILP分子标记可有效区分供试亲本的籼粳属性，是一种有效的水稻籼粳分类工具。采用籼/偏籼方式配组较易筛选到强优组合;虽然采用籼/偏粳方式配组获得高产组合的概率较低，但有机会获得极高产组合。
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（责任编辑 陈 燕）