【摘 要】
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[目的]利用MS2噬菌体外壳蛋白可在体外自组装并包封外源核酸的特点,制备RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒质控品,并研究其稳定性和耐Rnase降解特性.[方法]选择猪流行性腹泻病毒保
【机 构】
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河南中医药大学中医药科学院,河南郑州450046;河南省农业科学院,河南郑州450002;河南中医药大学药学院,河南郑州450046;河南中医药大学基础医学院,河南郑州450046
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[目的]利用MS2噬菌体外壳蛋白可在体外自组装并包封外源核酸的特点,制备RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒质控品,并研究其稳定性和耐Rnase降解特性.[方法]选择猪流行性腹泻病毒保守性强的N蛋白基因为靶序列,插入到携带有MS2噬菌体外壳蛋白和PAC位点基因的下游,构建重组载体,经原核表达系统,表达重组蛋白,目的蛋白经过硫酸铵和凝胶过滤层析纯化,以及Benzonase核酸酶消化,利用电镜对嵌合蛋白进行物理表征,通过Taqman荧光RT-PCR验证盔甲RNA热稳定性及耐Rnase攻击能力.[结果]成功构建包含MS2噬菌体外壳蛋白、PAC位点和猪流行性腹泻病毒靶基因的重组载体.经过原核表达和纯化,得到均一的、直径为23～28 nm的MS2病毒样颗粒,该颗粒经核酸酶消化、RNA提取和荧光RT-PCR,证实其形成了包封靶基因的盔甲RNA.该盔甲RNA可以耐受Rnase的降解,并且无菌条件下可在37℃稳定存在15 d.[结论]MS2噬菌体外壳蛋白体外包封PEDV N蛋白靶序列制备的病毒样颗粒,可以作为RT-PCR检测猪流行性腹泻病毒的质控品(盔甲RNA),其热稳定性好,耐Rnase攻击,可全程监控整个检测过程.
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