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摘要：【目的】利用GC-MS代謝组学技术研究阿苯达唑对患微粒子病家蚕血淋巴代谢物的影响，从代谢组学角度阐明阿苯达唑的作用机制，为以阿苯达唑为主剂研发新的家蚕微粒子病治疗药物提供理论依据。【方法】对五龄起蚕接种家蚕微孢子虫（Nosema bombycis，N.b）建立家蚕微粒子病模型，分别于攻毒后12、24、48、72和96 h开始饲喂阿苯达唑混悬液处理桑叶直至上蔟结茧，以未攻毒未给药的家蚕为对照，待化蛹后逐头镜检调查家蚕感染率，以评价阿苯达唑的治疗效果;同时采用GC-MS代谢组学技术进行非靶向代谢组学研究，筛选患微粒子病蚕体血淋巴中的差异代谢物，并通过MetaboAnalyst 4.0进行代谢通路分析。【结果】阿苯达唑对家蚕微粒子病具有显著的治疗效果，药物作用的关键时间是攻毒后24～48 h。与对照组家蚕血淋巴相比，从模型组家蚕血淋巴中共筛选并定性获得47种差异代谢物，其中27种代谢物呈下降趋势、20种代谢物呈上升趋势。对模型组与阿苯达唑给药组的家蚕血淋巴样本进行比较分析，结果发现除木酮糖、D-葡萄糖-6-磷酸、肌醇、泛酸、甲基丁二酸和油酸外，阿苯达唑对多数与家蚕微粒子病相关的代谢物具有干预调节作用。通过MetaboAnalyst 4.0进行通路分析，发现家蚕感染N.b后有6条主要的代谢通路发生明显变化，分别为：①淀粉和蔗糖代谢;②苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成;③苯丙氨酸代谢;④甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢;⑤谷胱甘肽代谢;⑥磷酸肌醇代谢。家蚕添食阿苯达唑混悬液处理桑叶后能有效减轻上述代谢通路的改变，从而促使患微粒子病家蚕处于较正常的生理状态。【结论】阿苯达唑对家蚕微粒子病具有显著的治疗效果，药物作用的关键时间在N.b感染后24～48 h，结合N.b的生活史，可全面揭示阿苯达唑治疗家蚕微粒子病的作用机制，即阿苯达唑通过抑制N.b在蚕体内的裂殖体增殖，有效降低N.b感染对家蚕氨基酸代谢和能量代谢的破坏作用，维持家蚕的正常生理状态，而达到治疗效果。
关键词： 家蚕微粒子病;家蚕微孢子虫（N.b）;阿苯达唑;代谢组学;GC-MS
中图分类号： S884.21 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）07-1735-10
Therapeutic mechanism of albendazole in treating pebrine disease of Bombyx mori based on GC-MS metabonomics analysis
XING Dong-xu1， LIAO Sen-tai1， HUANG Wen-jie2， LI Qing-rong1， XIAO Yang1，
ZHAO Chao-yi1， YAN Shi-juan2， JIANG Man-gui3， HUANG Xu-hua3*， YANG Qiong1*
（1Sericulture and Agri-food Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510610， China; 2Agro-biological Gene Research Center， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510640， China; 3Guangxi Academy of Sericulture Sciences， Nanning 530007， China）
Abstract：【Objective】GC-MS metabolomics was used to investigate the effect of albendazole on hemolymph metabolites of Bombyx mori with pebrine disease， and to clarify the action mechanism of albendazole from the perspective of metabolomics， so as to provide a theoretical basis for developing new therapeutic drugs for pebrine disease with albendazole as the main agent. 【Method】The model of pebrine disease was established by inoculating 5th instar Bombyx mori larvae with Nosema bombycis（N.b）. The mulberry leaves coating with albendazole suspension were fed at 12， 24， 48， 72 and 96 h after inoculation until cocooning. The silkworms without inoculation and administration was used as the control. The infection rate was investigated by individual microscopic examination at pupal stage and the therapeutic effect was evaluated; GC-MS was used to conduct the non-targeted metabonomics study to search the hemolymph related differential metabolites in silkworms with pebrine disease， and the related metabolic pathways were constructed by MetaboAnalyst 4.0. 【Result】The results showed that albendazole had a significant therapeutic effect on pebrine disease， and the key time was 24-48 h after inoculation. Compared with the control group， a total of 47 different metabolites were screened and identified from the hemolymph of B.mori in the model group， of which 27 metabolites showed a downward trend and 20 meta-bolites showed an upward trend. The comparative analysis of the hemolymph samples between the model group and the albendazole treatment group showed that albendazole had an intervention and regulation effect on most metabolites related to pebrine disease except xylulose， D-glucose 6-phosphate， inositol， pantothenic acid， methylsuccinic acid and oleic acid. Six metabolic pathways changed greatly after infection with N.b by MetaboAnalyst 4.0， which were as follows：① starch and sucrose metabolism; ② biosynthesis of phenylalanine， tyrosine and tryptophan; ③ phenylalanine metabolism; ④ glycine， serine and threonine metabolism; ⑤ glutathione metabolism; ⑥ inositol phosphate metabolism. The albendazole suspension treatment could effectively reduce the changes of the above metabolic pathways， so as to promote the silkworms suffering from pebrine disease in a more normal physiological state. 【Conclusion】Albendazole had a significant therapeutic effect on pebrine disease of B. mori. The key time of drug action was 24-48 h after N.b infection. Combined with the life cycle of N.b， the mechanism of albendazole in the treatment of pebrine disease can be fully revealed. Albendazole can effectively reduce the the destruction of amino acid metabolism and energy metabolism by N.b infection by inhibiting the proliferation of the meronts in silkworms， thus maintaining the normal physiological state of B. mori and achieve healing effects. Key words： silkworm pebrine disease; Nosema bombycis（N.b）; albendazole; metabonomics; GC-MS
Foundation item：Youth Project of National Natural Science Foundation of China（31702189）; General Project of Guangdong Natural Science Foundation（2021A1515010595）; Guangdong Agricultural Science and Technology Innovation and Promotion System Construction Project（2021KJ124）
0 引言
【研究意義】家蚕微粒子病是微孢子虫感染家蚕引起的一种毁灭性传染性蚕病，具有食下和胚种2种传染途径，是蚕业上唯一的法定检疫对象（黄旭华等，2012，2020）。我国蚕区家蚕病原性微孢子虫分布广泛，种类繁多，且各种微孢子虫的感染力存在明显差异（黄旭华等，2018），防治家蚕微粒子病是蚕业生产的重点和难点，但生产上仍沿用传统镜检母蛾淘汰带毒蚕种预防为主的被动防治策略，至今尚缺乏有效的治疗手段（鲁兴萌和邵勇奇，2016）。因此，研发家蚕微粒子病治疗药物并明确其作用机理，对蚕业生产上有效防控家蚕微粒子病具有重要意义。【前人研究进展】化学药物防治昆虫微孢子虫在国外已有若干尝试，如在蜜蜂群落上成功采用烟曲霉素有效控制西方蜜蜂微孢子虫感染（Higes et al.，2011）;草酸和ApiHerb?对东方蜜蜂微孢子虫感染均表现出良好的防治效果（Nanetti et al.，2015;Michalczyk and Sokó?，2018）;此外，一些含有天然化合物的配方药物也被用于治疗蜂群C型微粒子虫病（Botías et al.，2013）。阿苯达唑（Albendazole，ABZ）是一种咪唑衍生物类广谱驱肠虫药物，具有高效低毒的特点，已广泛应用于治疗由线虫、吸虫及绦虫等病原微生物引起的疾病（李晓婷等，2019）。Haque等（1993）研究表明，阿苯达唑在体外和体内均具有抗家蚕微孢子虫（Nosema bombycis，N.b）的活性，可有效控制家蚕微粒子病的发展;Boohene等（2003）研究证实，采用3%阿苯达唑能有效降低成年盗捕金小蜂微粒子虫经卵传播，但未能完全清除感染。Johny等（2009）在蝗虫中通过血腔注射法评估噻菌灵、奎宁、阿苯达唑和烟曲霉素等4种抗生素对脑炎微孢子虫的防治效果，结果发现这些药物能使微孢子虫数量显著减少，但未能消除感染。在国内，广东省农科院蚕业研究所蚕病组（1979）最早报道了苯来特、多菌灵和托布津等化学药物对家蚕微粒子病的治疗作用;刘仕贤等（1993）以多菌灵为主剂成功研发出防治家蚕微粒子病的药物——防微灵，并获得国家兽药产品批准文号（兽药字〔2012〕190099841）;曹宁宁等（2016）研究表明以防微灵处理的桑叶饲喂原蚕，其繁育系数较漂白粉液处理略有提高，且防微灵使用方便、操作简单，即在蚕种生产中表现出良好的防治效果，使家蚕微粒子病防治措施由预防为主转变为预防与治疗相结合，有效保障了我国蚕种生产安全（廖森泰等，2016）。此外，贡成良等（2000）研究发现，五龄起蚕感染N.b后采用复配TAAL进行治疗，其母蛾带毒率可降低30%左右。鲁兴萌等（2000）、钱永华等（2001）研究证明咪唑类药物能抑制N.B增殖或降低家蚕微粒子病发生率。田发芳等（2020）研究表明，用50%克微1号可湿性粉剂1000倍稀释液喷洒桑园桑叶表面，再连续不间断饲蚕直至上蔟，家蚕微粒子病得到有效控制，且具有节省劳动力和降低劳动强度的优势。【本研究切入点】沈中元等（1997）、杨琼等（2010）、黄旭华等（2016）先后证实阿苯达唑对家蚕微粒子病具有显著的治疗效果，并研发出以阿苯达唑为主剂的家蚕微粒子病治疗药物，但这些药物的作用机制及其对家蚕血淋巴代谢物的影响均有待进一步探究。【拟解决的关键问题】建立家蚕微粒子病模型，调查阿苯达唑对家蚕微粒子病的治疗作用，并利用GC-MS代谢组学技术研究阿苯达唑对患微粒子病家蚕血淋巴代谢物的影响，从代谢组学角度阐明阿苯达唑的作用机制，以期为以阿苯达唑为主剂研发新的家蚕微粒子病治疗药物提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试的N.b由广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所继代保存，供试家蚕品种春5由广东家蚕种质资源库提供。
1. 2 阿苯达唑对家蚕微粒子病的治疗作用调查
将阿苯达唑配制成混悬液（主剂浓度为1000 mg/L），桑叶放入混悬液中完全浸湿，取出后晾干备用。以N.b孢子液（1×106个/mL）均匀涂抹桑叶，桑叶稍微晾干后添食接种五龄起蚕，4 h后饲喂正常桑叶，分别于攻毒后12、24、48、72和96 h开始饲喂阿苯达唑混悬液处理桑叶直至上蔟结茧，化蛹后逐头进行显微镜检，统计家蚕微粒子病感染率，计算相对治疗效果。试验以攻毒但未给药为模型组，未攻毒未给药为对照组，每组设3个重复，每个重复50头家蚕。相对治疗效果（%）=（1-处理组发病率/模型组发病率）×100。
1. 3 代谢组样本制备
阿苯达唑给药组以1×106个/mL的N.b孢子液均匀涂抹桑叶，添食接种四龄起蚕，4 h后以阿苯达唑混悬液处理桑叶饲育至五龄第3 d，用无菌注射器刺破家蚕尾足并在冰上收集家蚕血淋巴，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存备用。同时设模型组和对照组，每组设6个重复，每个重复5头家蚕。取冻存的家蚕血淋巴样本在室温下解冻，涡旋振荡5 s。取20.0 μL蚕血淋巴置于2 mL的EP管中，加入80.0 μL甲醇，涡旋振荡30 s，然后4 ℃下14000×g离心15 min，吸取80.0 μL上清液置于高回收率玻璃衍生小瓶中，加入10.0 μL L-苯丙氨酸内标液（0.1 mg/mL），将提取液用温和的氮气吹干。向干燥物中加入30.0 μL盐酸甲氧胺吡啶溶液（20 mg/mL），37 ℃培养箱中肟化反应90 min，再加入30.0 μL BSTFA衍生试剂[含1%三甲基氯硅烷（TMCS）]，70 ℃下继续反应60 min。处理后的样本用于GC-MS代谢组学分析。 1. 4 GC-MS代谢组学分析
采用Agilent-7890-A-5975C气相色谱—质谱联用仪进行GC-MS代谢组学分析。气相色谱（GC）条件：HP-5ms毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯氦气，载气流速6 mL/min。不分流进样，进样量0.5 μL，进样口温度280 ℃。初始柱温70 ℃，维持2 min，以6 ℃/min的速度升至160 ℃，再以10 ℃/min的速度升至240 ℃，最后以20 ℃/min的速度升至300 ℃，并保持6 min。质谱（MS）条件：电离方法为电子电离（EI），离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，采用全扫描采集模式进行质谱扫描，扫描范围（m/z）为50～600 amu。
1. 5 数据分析
将原始数据在R软件平台使用自写程序代码进行基线过滤、峰识别、峰积分、保留时间校正、峰对齐和质谱碎片归属分析，然后将试验数据导入Excel 2017進行后期编辑，最后将整理后的数据矩阵导入Simca-P 11.0进行多变量统计分析。构建正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）模型，按照模型第一主成分的变量投影重要性（Variable importance in the projection，VIP）>1.000，并结合Mann-Whitney U检验的P<0.05筛选差异代谢物。将代谢物保留时间和特征质荷比与自建的标准物数据库及NIST商业数据库比对，进行物质定性分析，通过MetaboAnalyst 4.0（http：//www.metaboanalyst.ca）进行代谢通路分析（Pathway analysis）。采用SPSS 23.0对试验数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。
2 结果与分析
2. 1 阿苯达唑对家蚕微粒子病的治疗效果
于攻毒后不同时间通过饲喂阿苯达唑混悬液处理桑叶的方式进行给药，其相对治疗效果如图1所示。攻毒12和24 h后，以阿苯达唑给药组的治疗效果最佳，与对照组一致，在蚕蛹样本内均未检测到N.b。攻毒48 h后，阿苯达唑给药组的相对治疗效果有所降低，为（90.10±1.36）%。攻毒72和96 h后，阿苯达唑给药组的治疗效果已不明显，相对治疗效果分别为（25.80±10.24）%和（20.08±5.37）%。进一步证实阿苯达唑对家蚕微粒子病有显著的治疗效果，并揭示药物作用的关键时间是攻毒后24～48 h。
2. 2 代谢轮廓分析结果
为了直观展示家蚕微粒子病模型组与对照组家蚕血淋巴样本间的差异，首先对这2组样本进行主成分分析（PCA），结果如图2-A所示。模型组和对照组家蚕血淋巴样本在PCA得分图上能较好地区分开。由于PCA分析是无监督模式的识别分析方法，为使样本最大化分离，达到更好的组间分类效果，因此进一步建立偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）模型，并进行随机置换检验（n=200），其排列试验结果（图2-B）显示，R2=0.735，Q2= -0.523，表明PLS-DA模型质量可靠，模型稳定性及预测能力较优。PLS-DA模型分析也发现，模型组和对照组家蚕血淋巴样本分别位于PLS-DA图的左右2个区域，表明家蚕血淋巴样本间存在明显的代谢差异。
2. 3 差异代谢物鉴定结果
为获得模型组和对照组家蚕血淋巴样本间更加可靠且具有显著差异的代谢物信息，建立OPLS-DA模型，并绘制得分图和载荷图，以寻找贡献值较大的变量（图3）。在OPLS-DA载荷图中，横坐标表示预测主成分，纵坐标表示正交主成分;2个蓝色圆点代表模型组和对照组的虚拟位置，离蓝色圆点越近的X变量则表明该代谢物具有更好区分两组家蚕血淋巴样品的能力。结合VIP>1.000和P<0.05筛选出差异性代谢物，然后通过搜索自建的标准物数据库和NIST商业数据库对差异代谢物进行定性分析。与对照组家蚕血淋巴相比，从模型组家蚕血淋巴中共筛选并定性获得47种差异代谢物，结果见表2。其中，27种代谢物呈下降趋势，分别是4，5-二甲基-2，6-二羟基嘧啶、D-赤糖酸-γ-内酯、胱硫醚、木酮糖、甘露糖-6-磷酸、赖氨酸、胆固醇、D-葡萄糖-6-磷酸、L-鸟氨酸、2-甲基柠檬酸、对羟基苯甲酸、阿拉伯呋喃糖、α-亚麻酸、6-磷酸-葡萄糖酸、3-磷酸甘油、β-谷甾醇、2-氨基己二酸、苯丙氨酸、磷酸甲酯、肌醇、哌啶酸、麦芽糖、2-甲基苹果酸、D-核糖-6-磷酸、泛酸、海藻糖和甲基丁二酸;20种代谢物呈上升趋势，分别是多巴、尿囊素、1-甲基-L-组氨酸、5-羟基哌啶酸、尿嘧啶、尿酸、组胺、谷氨酰胺、N-乙酰谷氨酰胺-6-磷酸、油酸、氨基丙二酸、3，6-二羟基己酸、L-苏氨酸、2-单棕榈酸甘油、甘氨酸、AMDA（q-aminomethyl-9，10-dihydroanthracene）、琥珀酸、6-羟基-2-氨基己酸、3-氨基-2-哌啶酮和奎宁酸。
2. 4 阿苯达唑对家蚕血淋巴代谢的影响
为了明确阿苯达唑对家蚕血淋巴代谢的影响，对模型组、对照组和阿苯达唑给药组家蚕血淋巴样本进行PCA和OPLS-DA分析，结果如图4所示。模型组和对照组家蚕血淋巴样本在PCA得分图（图4-A）上能有效区分，而阿苯达唑给药组家蚕血淋巴代谢轮廓明显趋向于对照组;模型组、对照组和阿苯达唑给药组家蚕血淋巴样本在OPLS-DA得分图（图4-B）上能较好地区分开。由表2已知，与对照组家蚕血淋巴相比，家蚕感染N.b后（模型组）其血淋巴代谢物发生明显变化，27种代谢物呈下降趋势，20种代谢物呈上升趋势。以模型组家蚕血淋巴为参照，分析上述差异代谢物在阿苯达唑给药组家蚕血淋巴中的变化趋势，若变化趋势相反则表明阿苯达唑对感染N.b家蚕血淋巴代谢物具有干预调节作用，具体变化趋势见表2，结果发现除木酮糖、D-葡萄糖-6-磷酸、肌醇、泛酸、甲基丁二酸和油酸外，阿苯达唑对多数与家蚕微粒子病相关的代谢物具有干预调节作用。 2. 5 代谢通路分析结果
利用筛选到的差异性代谢物（表2），通过MetaboAnalyst 4.0进行通路分析，以发现与家蚕微粒子病相关的代谢通路。由图5可看出，家蚕感染N.b后有6条主要的代谢通路发生明显变化，分别为：①淀粉和蔗糖代谢;②苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成;③苯丙氨酸代谢;④甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢;⑤谷胱甘肽代谢;⑥磷酸肌醇代谢。家蚕添食阿苯达唑浸湿桑叶后能有效减轻上述代谢通路的改变，从而促使患微粒子病家蚕处于较正常的生理状态。其中，模型组家蚕血淋巴中的赖氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和甘氨酸代谢水平均发生显著变化。与对照组家蚕血淋巴相比，赖氨酸、鸟氨酸和苯丙氨酸代谢水平显著下调，而甘氨酸和苏氨酸代谢水平显著上调。
3 讨论
阿苯达唑是一种广谱的苯并咪唑类杀虫剂，多用于驱蛔虫、蛲虫、绦虫、鞭虫、钩虫及粪圆线虫等（Goyal et al.，2018）。因具有高效低毒的特点，在畜禽养殖和水产养殖业上已得到广泛应用（Movahedi et al.，2017）。沈中元等（1997）研究表明，以阿苯达唑为主剂的克微1号对家蚕微粒子病具有明显治疗作用，且0.2～2.0 g/L的药液浓度均能达到完全治愈的效果。本研究的养蚕试验结果也表明，攻毒12和24 h后阿苯达唑给药组的家蚕治疗效果均达100.00%，攻毒48 h后阿苯达唑给药组的治疗效果有所降低[（90.10±1.36）%]，攻毒72和96 h后阿苯达唑给药组的治疗效果已不明显，揭示阿苯达唑作用的关键时间在接种N.b后的24～48 h，此时正值N.b在蚕体内的裂殖体增殖阶段（Xing et al.，2014）。据相关文献报道，苯并咪唑类药物可通过结合病原菌β-微管蛋白单体而抑制微管形成，从而阻止细胞有丝分裂（Akiyoshi et al.，2007;Li et al.，2014），故推测阿苯达唑是通过抑制N.b在家蚕体内的裂殖体增殖而达到治疗效果。
家蚕微粒子病是N.b感染家蚕而引起的一种慢性传染病（Pan et al.，2013）。感染N.b的家蚕体色暗淡，行动呆滞，食欲减退，发育迟缓，群体大小不齐，蚕体背部或气门线上下出现黑褐色斑点。代谢组学是对生物体病理生理刺激产生的代谢物变化进行测定分析，为了解疾病的致病机理提供新手段（Nicholson et al.，1999）。本研究结果显示，患家蚕微粒子病蚕体血淋巴中的代谢物谱已发生明显变化，27种代谢物呈下降趋势，20种代谢物呈上升趋势。这些代谢物主要包括氨基酸、糖类和有机酸等物质，涉及6条主要的代谢通路，主要与氨基酸代谢和能量代谢密切相关，说明N.b感染导致家蚕的氨基酸代谢和能量代谢被破坏，引起家蚕的生理障碍和组织器官功能丧失。
N.b可通过宿主线粒体为其提供能量，致使寄主的正常代谢出现异常或发生细胞凋亡（Lom and Nilsen，2003;Williams et al.，2008）。家蚕的碳水化合物代谢包括糖酵解、戊糖循环和三羧酸循环。海藻糖是存在于昆虫血淋巴中含量最高的糖类物质，与血糖的作用类似，是重要的储能物质之一，参与体内的糖代谢过程（Elbein et al.，2003;Shukla et al.，2015）。正常状态下，家蚕体液中的海藻糖含量相对稳定;但在感染N.b的家蚕血淋巴中海藻糖、D-葡萄糖-6-磷酸、6-磷酸-葡萄糖酸和麦芽糖等均明显下降，即N.b侵染家蚕后其能量代谢出现异常。此外，模型组家蚕血淋巴中的赖氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和甘氨酸代谢水平均发生显著变化。与对照组家蚕血淋巴相比，赖氨酸、鸟氨酸和苯丙氨酸代谢水平显著下调，而甘氨酸和苏氨酸代谢水平显著上调。甘氨酸是合成蚕丝蛋白的主要氨基酸（Chen et al.，2015），其含量增多可能是由于家蚕丝腺受损，丝蛋白合成受阻导致相关氨基酸在血淋巴中富集。苯丙氨酸可生成酪氨酸，然后经酚酶氧化生成多巴，多巴可进一步生成黑色素，而参与昆虫的黑化反应（Fuchs et al.，2014）。
本研究的PCA和OPLS-DA分析发现，模型组和对照组家蚕血淋巴样本能较好地区分开，而阿苯达唑给药组家蚕血淋巴样本的代谢轮廓明显趋向于对照组。除木酮糖、D-葡萄糖-6-磷酸、肌醇、泛酸、甲基丁二酸和油酸外，阿苯达唑给药组家蚕血淋巴中与家蚕微粒子病相关的代谢物均呈现出回调趋势，说明阿苯达唑通过抑制N.b增殖，有效降低病原微生物对家蚕代谢的破坏作用，从而维持家蚕的正常生理状态。
4 结论
阿苯达唑对家蚕微粒子病具有显著的治疗效果，药物作用的关键时间在N.b感染后24～48 h，结合N.b的生活史，可全面揭示阿苯达唑治疗家蚕微粒子病的作用机制，即阿苯达唑通过抑制N.b在蚕体内的裂殖体增殖，有效降低N.b感染对家蚕氨基酸代谢和能量代谢的破坏作用，维持家蚕的正常生理状态，而达到治疗效果。
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（責任编辑 兰宗宝）
关键词： 家蚕微粒子病;家蚕微孢子虫（N.b）;阿苯达唑;代谢组学;GC-MS
中图分类号： S884.21 文献标志码： A 文章编号：2095-1191（2021）07-1735-10
Therapeutic mechanism of albendazole in treating pebrine disease of Bombyx mori based on GC-MS metabonomics analysis
XING Dong-xu1， LIAO Sen-tai1， HUANG Wen-jie2， LI Qing-rong1， XIAO Yang1，
ZHAO Chao-yi1， YAN Shi-juan2， JIANG Man-gui3， HUANG Xu-hua3*， YANG Qiong1*
（1Sericulture and Agri-food Research Institute， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510610， China; 2Agro-biological Gene Research Center， Guangdong Academy of Agricultural Sciences， Guangzhou 510640， China; 3Guangxi Academy of Sericulture Sciences， Nanning 530007， China）
Abstract：【Objective】GC-MS metabolomics was used to investigate the effect of albendazole on hemolymph metabolites of Bombyx mori with pebrine disease， and to clarify the action mechanism of albendazole from the perspective of metabolomics， so as to provide a theoretical basis for developing new therapeutic drugs for pebrine disease with albendazole as the main agent. 【Method】The model of pebrine disease was established by inoculating 5th instar Bombyx mori larvae with Nosema bombycis（N.b）. The mulberry leaves coating with albendazole suspension were fed at 12， 24， 48， 72 and 96 h after inoculation until cocooning. The silkworms without inoculation and administration was used as the control. The infection rate was investigated by individual microscopic examination at pupal stage and the therapeutic effect was evaluated; GC-MS was used to conduct the non-targeted metabonomics study to search the hemolymph related differential metabolites in silkworms with pebrine disease， and the related metabolic pathways were constructed by MetaboAnalyst 4.0. 【Result】The results showed that albendazole had a significant therapeutic effect on pebrine disease， and the key time was 24-48 h after inoculation. Compared with the control group， a total of 47 different metabolites were screened and identified from the hemolymph of B.mori in the model group， of which 27 metabolites showed a downward trend and 20 meta-bolites showed an upward trend. The comparative analysis of the hemolymph samples between the model group and the albendazole treatment group showed that albendazole had an intervention and regulation effect on most metabolites related to pebrine disease except xylulose， D-glucose 6-phosphate， inositol， pantothenic acid， methylsuccinic acid and oleic acid. Six metabolic pathways changed greatly after infection with N.b by MetaboAnalyst 4.0， which were as follows：① starch and sucrose metabolism; ② biosynthesis of phenylalanine， tyrosine and tryptophan; ③ phenylalanine metabolism; ④ glycine， serine and threonine metabolism; ⑤ glutathione metabolism; ⑥ inositol phosphate metabolism. The albendazole suspension treatment could effectively reduce the changes of the above metabolic pathways， so as to promote the silkworms suffering from pebrine disease in a more normal physiological state. 【Conclusion】Albendazole had a significant therapeutic effect on pebrine disease of B. mori. The key time of drug action was 24-48 h after N.b infection. Combined with the life cycle of N.b， the mechanism of albendazole in the treatment of pebrine disease can be fully revealed. Albendazole can effectively reduce the the destruction of amino acid metabolism and energy metabolism by N.b infection by inhibiting the proliferation of the meronts in silkworms， thus maintaining the normal physiological state of B. mori and achieve healing effects. Key words： silkworm pebrine disease; Nosema bombycis（N.b）; albendazole; metabonomics; GC-MS
Foundation item：Youth Project of National Natural Science Foundation of China（31702189）; General Project of Guangdong Natural Science Foundation（2021A1515010595）; Guangdong Agricultural Science and Technology Innovation and Promotion System Construction Project（2021KJ124）
0 引言
【研究意義】家蚕微粒子病是微孢子虫感染家蚕引起的一种毁灭性传染性蚕病，具有食下和胚种2种传染途径，是蚕业上唯一的法定检疫对象（黄旭华等，2012，2020）。我国蚕区家蚕病原性微孢子虫分布广泛，种类繁多，且各种微孢子虫的感染力存在明显差异（黄旭华等，2018），防治家蚕微粒子病是蚕业生产的重点和难点，但生产上仍沿用传统镜检母蛾淘汰带毒蚕种预防为主的被动防治策略，至今尚缺乏有效的治疗手段（鲁兴萌和邵勇奇，2016）。因此，研发家蚕微粒子病治疗药物并明确其作用机理，对蚕业生产上有效防控家蚕微粒子病具有重要意义。【前人研究进展】化学药物防治昆虫微孢子虫在国外已有若干尝试，如在蜜蜂群落上成功采用烟曲霉素有效控制西方蜜蜂微孢子虫感染（Higes et al.，2011）;草酸和ApiHerb?对东方蜜蜂微孢子虫感染均表现出良好的防治效果（Nanetti et al.，2015;Michalczyk and Sokó?，2018）;此外，一些含有天然化合物的配方药物也被用于治疗蜂群C型微粒子虫病（Botías et al.，2013）。阿苯达唑（Albendazole，ABZ）是一种咪唑衍生物类广谱驱肠虫药物，具有高效低毒的特点，已广泛应用于治疗由线虫、吸虫及绦虫等病原微生物引起的疾病（李晓婷等，2019）。Haque等（1993）研究表明，阿苯达唑在体外和体内均具有抗家蚕微孢子虫（Nosema bombycis，N.b）的活性，可有效控制家蚕微粒子病的发展;Boohene等（2003）研究证实，采用3%阿苯达唑能有效降低成年盗捕金小蜂微粒子虫经卵传播，但未能完全清除感染。Johny等（2009）在蝗虫中通过血腔注射法评估噻菌灵、奎宁、阿苯达唑和烟曲霉素等4种抗生素对脑炎微孢子虫的防治效果，结果发现这些药物能使微孢子虫数量显著减少，但未能消除感染。在国内，广东省农科院蚕业研究所蚕病组（1979）最早报道了苯来特、多菌灵和托布津等化学药物对家蚕微粒子病的治疗作用;刘仕贤等（1993）以多菌灵为主剂成功研发出防治家蚕微粒子病的药物——防微灵，并获得国家兽药产品批准文号（兽药字〔2012〕190099841）;曹宁宁等（2016）研究表明以防微灵处理的桑叶饲喂原蚕，其繁育系数较漂白粉液处理略有提高，且防微灵使用方便、操作简单，即在蚕种生产中表现出良好的防治效果，使家蚕微粒子病防治措施由预防为主转变为预防与治疗相结合，有效保障了我国蚕种生产安全（廖森泰等，2016）。此外，贡成良等（2000）研究发现，五龄起蚕感染N.b后采用复配TAAL进行治疗，其母蛾带毒率可降低30%左右。鲁兴萌等（2000）、钱永华等（2001）研究证明咪唑类药物能抑制N.B增殖或降低家蚕微粒子病发生率。田发芳等（2020）研究表明，用50%克微1号可湿性粉剂1000倍稀释液喷洒桑园桑叶表面，再连续不间断饲蚕直至上蔟，家蚕微粒子病得到有效控制，且具有节省劳动力和降低劳动强度的优势。【本研究切入点】沈中元等（1997）、杨琼等（2010）、黄旭华等（2016）先后证实阿苯达唑对家蚕微粒子病具有显著的治疗效果，并研发出以阿苯达唑为主剂的家蚕微粒子病治疗药物，但这些药物的作用机制及其对家蚕血淋巴代谢物的影响均有待进一步探究。【拟解决的关键问题】建立家蚕微粒子病模型，调查阿苯达唑对家蚕微粒子病的治疗作用，并利用GC-MS代谢组学技术研究阿苯达唑对患微粒子病家蚕血淋巴代谢物的影响，从代谢组学角度阐明阿苯达唑的作用机制，以期为以阿苯达唑为主剂研发新的家蚕微粒子病治疗药物提供理论依据。
1 材料与方法
1. 1 试验材料
供试的N.b由广东省农业科学院蚕业与农产品加工研究所继代保存，供试家蚕品种春5由广东家蚕种质资源库提供。
1. 2 阿苯达唑对家蚕微粒子病的治疗作用调查
将阿苯达唑配制成混悬液（主剂浓度为1000 mg/L），桑叶放入混悬液中完全浸湿，取出后晾干备用。以N.b孢子液（1×106个/mL）均匀涂抹桑叶，桑叶稍微晾干后添食接种五龄起蚕，4 h后饲喂正常桑叶，分别于攻毒后12、24、48、72和96 h开始饲喂阿苯达唑混悬液处理桑叶直至上蔟结茧，化蛹后逐头进行显微镜检，统计家蚕微粒子病感染率，计算相对治疗效果。试验以攻毒但未给药为模型组，未攻毒未给药为对照组，每组设3个重复，每个重复50头家蚕。相对治疗效果（%）=（1-处理组发病率/模型组发病率）×100。
1. 3 代谢组样本制备
阿苯达唑给药组以1×106个/mL的N.b孢子液均匀涂抹桑叶，添食接种四龄起蚕，4 h后以阿苯达唑混悬液处理桑叶饲育至五龄第3 d，用无菌注射器刺破家蚕尾足并在冰上收集家蚕血淋巴，液氮速冻后置于-80 ℃冰箱保存备用。同时设模型组和对照组，每组设6个重复，每个重复5头家蚕。取冻存的家蚕血淋巴样本在室温下解冻，涡旋振荡5 s。取20.0 μL蚕血淋巴置于2 mL的EP管中，加入80.0 μL甲醇，涡旋振荡30 s，然后4 ℃下14000×g离心15 min，吸取80.0 μL上清液置于高回收率玻璃衍生小瓶中，加入10.0 μL L-苯丙氨酸内标液（0.1 mg/mL），将提取液用温和的氮气吹干。向干燥物中加入30.0 μL盐酸甲氧胺吡啶溶液（20 mg/mL），37 ℃培养箱中肟化反应90 min，再加入30.0 μL BSTFA衍生试剂[含1%三甲基氯硅烷（TMCS）]，70 ℃下继续反应60 min。处理后的样本用于GC-MS代谢组学分析。 1. 4 GC-MS代谢组学分析
采用Agilent-7890-A-5975C气相色谱—质谱联用仪进行GC-MS代谢组学分析。气相色谱（GC）条件：HP-5ms毛细管色谱柱（30 m×0.25 mm×0.25 μm），载气为高纯氦气，载气流速6 mL/min。不分流进样，进样量0.5 μL，进样口温度280 ℃。初始柱温70 ℃，维持2 min，以6 ℃/min的速度升至160 ℃，再以10 ℃/min的速度升至240 ℃，最后以20 ℃/min的速度升至300 ℃，并保持6 min。质谱（MS）条件：电离方法为电子电离（EI），离子源温度230 ℃，四极杆温度150 ℃，采用全扫描采集模式进行质谱扫描，扫描范围（m/z）为50～600 amu。
1. 5 数据分析
将原始数据在R软件平台使用自写程序代码进行基线过滤、峰识别、峰积分、保留时间校正、峰对齐和质谱碎片归属分析，然后将试验数据导入Excel 2017進行后期编辑，最后将整理后的数据矩阵导入Simca-P 11.0进行多变量统计分析。构建正交偏最小二乘法判别分析（OPLS-DA）模型，按照模型第一主成分的变量投影重要性（Variable importance in the projection，VIP）>1.000，并结合Mann-Whitney U检验的P<0.05筛选差异代谢物。将代谢物保留时间和特征质荷比与自建的标准物数据库及NIST商业数据库比对，进行物质定性分析，通过MetaboAnalyst 4.0（http：//www.metaboanalyst.ca）进行代谢通路分析（Pathway analysis）。采用SPSS 23.0对试验数据进行单因素方差分析（One-way ANOVA）。
2 结果与分析
2. 1 阿苯达唑对家蚕微粒子病的治疗效果
于攻毒后不同时间通过饲喂阿苯达唑混悬液处理桑叶的方式进行给药，其相对治疗效果如图1所示。攻毒12和24 h后，以阿苯达唑给药组的治疗效果最佳，与对照组一致，在蚕蛹样本内均未检测到N.b。攻毒48 h后，阿苯达唑给药组的相对治疗效果有所降低，为（90.10±1.36）%。攻毒72和96 h后，阿苯达唑给药组的治疗效果已不明显，相对治疗效果分别为（25.80±10.24）%和（20.08±5.37）%。进一步证实阿苯达唑对家蚕微粒子病有显著的治疗效果，并揭示药物作用的关键时间是攻毒后24～48 h。
2. 2 代谢轮廓分析结果
为了直观展示家蚕微粒子病模型组与对照组家蚕血淋巴样本间的差异，首先对这2组样本进行主成分分析（PCA），结果如图2-A所示。模型组和对照组家蚕血淋巴样本在PCA得分图上能较好地区分开。由于PCA分析是无监督模式的识别分析方法，为使样本最大化分离，达到更好的组间分类效果，因此进一步建立偏最小二乘法判别分析（PLS-DA）模型，并进行随机置换检验（n=200），其排列试验结果（图2-B）显示，R2=0.735，Q2= -0.523，表明PLS-DA模型质量可靠，模型稳定性及预测能力较优。PLS-DA模型分析也发现，模型组和对照组家蚕血淋巴样本分别位于PLS-DA图的左右2个区域，表明家蚕血淋巴样本间存在明显的代谢差异。
2. 3 差异代谢物鉴定结果
为获得模型组和对照组家蚕血淋巴样本间更加可靠且具有显著差异的代谢物信息，建立OPLS-DA模型，并绘制得分图和载荷图，以寻找贡献值较大的变量（图3）。在OPLS-DA载荷图中，横坐标表示预测主成分，纵坐标表示正交主成分;2个蓝色圆点代表模型组和对照组的虚拟位置，离蓝色圆点越近的X变量则表明该代谢物具有更好区分两组家蚕血淋巴样品的能力。结合VIP>1.000和P<0.05筛选出差异性代谢物，然后通过搜索自建的标准物数据库和NIST商业数据库对差异代谢物进行定性分析。与对照组家蚕血淋巴相比，从模型组家蚕血淋巴中共筛选并定性获得47种差异代谢物，结果见表2。其中，27种代谢物呈下降趋势，分别是4，5-二甲基-2，6-二羟基嘧啶、D-赤糖酸-γ-内酯、胱硫醚、木酮糖、甘露糖-6-磷酸、赖氨酸、胆固醇、D-葡萄糖-6-磷酸、L-鸟氨酸、2-甲基柠檬酸、对羟基苯甲酸、阿拉伯呋喃糖、α-亚麻酸、6-磷酸-葡萄糖酸、3-磷酸甘油、β-谷甾醇、2-氨基己二酸、苯丙氨酸、磷酸甲酯、肌醇、哌啶酸、麦芽糖、2-甲基苹果酸、D-核糖-6-磷酸、泛酸、海藻糖和甲基丁二酸;20种代谢物呈上升趋势，分别是多巴、尿囊素、1-甲基-L-组氨酸、5-羟基哌啶酸、尿嘧啶、尿酸、组胺、谷氨酰胺、N-乙酰谷氨酰胺-6-磷酸、油酸、氨基丙二酸、3，6-二羟基己酸、L-苏氨酸、2-单棕榈酸甘油、甘氨酸、AMDA（q-aminomethyl-9，10-dihydroanthracene）、琥珀酸、6-羟基-2-氨基己酸、3-氨基-2-哌啶酮和奎宁酸。
2. 4 阿苯达唑对家蚕血淋巴代谢的影响
为了明确阿苯达唑对家蚕血淋巴代谢的影响，对模型组、对照组和阿苯达唑给药组家蚕血淋巴样本进行PCA和OPLS-DA分析，结果如图4所示。模型组和对照组家蚕血淋巴样本在PCA得分图（图4-A）上能有效区分，而阿苯达唑给药组家蚕血淋巴代谢轮廓明显趋向于对照组;模型组、对照组和阿苯达唑给药组家蚕血淋巴样本在OPLS-DA得分图（图4-B）上能较好地区分开。由表2已知，与对照组家蚕血淋巴相比，家蚕感染N.b后（模型组）其血淋巴代谢物发生明显变化，27种代谢物呈下降趋势，20种代谢物呈上升趋势。以模型组家蚕血淋巴为参照，分析上述差异代谢物在阿苯达唑给药组家蚕血淋巴中的变化趋势，若变化趋势相反则表明阿苯达唑对感染N.b家蚕血淋巴代谢物具有干预调节作用，具体变化趋势见表2，结果发现除木酮糖、D-葡萄糖-6-磷酸、肌醇、泛酸、甲基丁二酸和油酸外，阿苯达唑对多数与家蚕微粒子病相关的代谢物具有干预调节作用。 2. 5 代谢通路分析结果
利用筛选到的差异性代谢物（表2），通过MetaboAnalyst 4.0进行通路分析，以发现与家蚕微粒子病相关的代谢通路。由图5可看出，家蚕感染N.b后有6条主要的代谢通路发生明显变化，分别为：①淀粉和蔗糖代谢;②苯丙氨酸、酪氨酸和色氨酸的生物合成;③苯丙氨酸代谢;④甘氨酸、丝氨酸和苏氨酸代谢;⑤谷胱甘肽代谢;⑥磷酸肌醇代谢。家蚕添食阿苯达唑浸湿桑叶后能有效减轻上述代谢通路的改变，从而促使患微粒子病家蚕处于较正常的生理状态。其中，模型组家蚕血淋巴中的赖氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和甘氨酸代谢水平均发生显著变化。与对照组家蚕血淋巴相比，赖氨酸、鸟氨酸和苯丙氨酸代谢水平显著下调，而甘氨酸和苏氨酸代谢水平显著上调。
3 讨论
阿苯达唑是一种广谱的苯并咪唑类杀虫剂，多用于驱蛔虫、蛲虫、绦虫、鞭虫、钩虫及粪圆线虫等（Goyal et al.，2018）。因具有高效低毒的特点，在畜禽养殖和水产养殖业上已得到广泛应用（Movahedi et al.，2017）。沈中元等（1997）研究表明，以阿苯达唑为主剂的克微1号对家蚕微粒子病具有明显治疗作用，且0.2～2.0 g/L的药液浓度均能达到完全治愈的效果。本研究的养蚕试验结果也表明，攻毒12和24 h后阿苯达唑给药组的家蚕治疗效果均达100.00%，攻毒48 h后阿苯达唑给药组的治疗效果有所降低[（90.10±1.36）%]，攻毒72和96 h后阿苯达唑给药组的治疗效果已不明显，揭示阿苯达唑作用的关键时间在接种N.b后的24～48 h，此时正值N.b在蚕体内的裂殖体增殖阶段（Xing et al.，2014）。据相关文献报道，苯并咪唑类药物可通过结合病原菌β-微管蛋白单体而抑制微管形成，从而阻止细胞有丝分裂（Akiyoshi et al.，2007;Li et al.，2014），故推测阿苯达唑是通过抑制N.b在家蚕体内的裂殖体增殖而达到治疗效果。
家蚕微粒子病是N.b感染家蚕而引起的一种慢性传染病（Pan et al.，2013）。感染N.b的家蚕体色暗淡，行动呆滞，食欲减退，发育迟缓，群体大小不齐，蚕体背部或气门线上下出现黑褐色斑点。代谢组学是对生物体病理生理刺激产生的代谢物变化进行测定分析，为了解疾病的致病机理提供新手段（Nicholson et al.，1999）。本研究结果显示，患家蚕微粒子病蚕体血淋巴中的代谢物谱已发生明显变化，27种代谢物呈下降趋势，20种代谢物呈上升趋势。这些代谢物主要包括氨基酸、糖类和有机酸等物质，涉及6条主要的代谢通路，主要与氨基酸代谢和能量代谢密切相关，说明N.b感染导致家蚕的氨基酸代谢和能量代谢被破坏，引起家蚕的生理障碍和组织器官功能丧失。
N.b可通过宿主线粒体为其提供能量，致使寄主的正常代谢出现异常或发生细胞凋亡（Lom and Nilsen，2003;Williams et al.，2008）。家蚕的碳水化合物代谢包括糖酵解、戊糖循环和三羧酸循环。海藻糖是存在于昆虫血淋巴中含量最高的糖类物质，与血糖的作用类似，是重要的储能物质之一，参与体内的糖代谢过程（Elbein et al.，2003;Shukla et al.，2015）。正常状态下，家蚕体液中的海藻糖含量相对稳定;但在感染N.b的家蚕血淋巴中海藻糖、D-葡萄糖-6-磷酸、6-磷酸-葡萄糖酸和麦芽糖等均明显下降，即N.b侵染家蚕后其能量代谢出现异常。此外，模型组家蚕血淋巴中的赖氨酸、鸟氨酸、苯丙氨酸、苏氨酸和甘氨酸代谢水平均发生显著变化。与对照组家蚕血淋巴相比，赖氨酸、鸟氨酸和苯丙氨酸代谢水平显著下调，而甘氨酸和苏氨酸代谢水平显著上调。甘氨酸是合成蚕丝蛋白的主要氨基酸（Chen et al.，2015），其含量增多可能是由于家蚕丝腺受损，丝蛋白合成受阻导致相关氨基酸在血淋巴中富集。苯丙氨酸可生成酪氨酸，然后经酚酶氧化生成多巴，多巴可进一步生成黑色素，而参与昆虫的黑化反应（Fuchs et al.，2014）。
本研究的PCA和OPLS-DA分析发现，模型组和对照组家蚕血淋巴样本能较好地区分开，而阿苯达唑给药组家蚕血淋巴样本的代谢轮廓明显趋向于对照组。除木酮糖、D-葡萄糖-6-磷酸、肌醇、泛酸、甲基丁二酸和油酸外，阿苯达唑给药组家蚕血淋巴中与家蚕微粒子病相关的代谢物均呈现出回调趋势，说明阿苯达唑通过抑制N.b增殖，有效降低病原微生物对家蚕代谢的破坏作用，从而维持家蚕的正常生理状态。
4 结论
阿苯达唑对家蚕微粒子病具有显著的治疗效果，药物作用的关键时间在N.b感染后24～48 h，结合N.b的生活史，可全面揭示阿苯达唑治疗家蚕微粒子病的作用机制，即阿苯达唑通过抑制N.b在蚕体内的裂殖体增殖，有效降低N.b感染对家蚕氨基酸代谢和能量代谢的破坏作用，维持家蚕的正常生理状态，而达到治疗效果。
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（責任编辑 兰宗宝）