论文部分内容阅读
心肌肌钙蛋白Ⅰ(cTn Ⅰ)是心肌的结构蛋白，具有高度的心肌组织特异性，但缺乏种属特异性。cTn Ⅰ现被证明是诊断急性心肌损伤疾病最特异、最敏感的血清标志物之一，可以为心肌损伤疾病的早期诊断提供依据。本研究借鉴国外文献资料，旨在从牛心肌组织中快速提纯cTn Ⅰ，获得高活性、高纯度、结构完整的免疫原，为进一步研制cTn Ⅰ单克隆抗体奠定基础。1 材料和方法1.1 材料 新鲜小牛心脏(-20 ℃保存1～6个月)。1.2 肌钙蛋白C(TnC)的纯化[1] 200 g牛心室肌剪碎，A液(50 mmol／L Tris-HCl pH 7.5，0.1 mol／L KCl，10mmol/L EDTA，l mmol／L 2-巯基乙醇)预冷后洗净血迹，加l L A液并置组织捣碎机中捣碎，10 000 r／min 4℃离心15min，弃上清。重复离心洗涤3次，沉淀加2 L B液(6 mol／L脲素，50 mmol/L Tris-HCl pH 7.5，0.1 mol/L KCl，10mmol/L EDTA，l mmol/L 2-巯基乙醇)，搅匀后4℃抽提2h，加入2 L蒸馏水稀释抽提物以降低粘稠度，离心取上清备用。15 g DEAE-Sephadex A25(Pharmacia)经膨胀处理后与上述心肌抽提液混匀，轻搅15 min，4℃静置过夜，次日倾去上清，沉淀装柱(40 cm×2.5 em)。以B液先洗脱游离杂蛋白，随后换用C液(6 mol／L脲素，50 mmol/L Tris-HCl pH7.5，0.1 mol／L KCl，0.7 mol／L NaCl，10 mmol／L EDTA，1 mol／L 2-巯基乙醇)洗脱，流速为每分钟0.8 ml，部分收集器收集，每管5 ml。用752紫外分光光度计在280 nm波长处测定各管光密度值，收集蛋白解离峰，用D液(20 mmol/LKH2PO4 pH 7.1，10 mmol／L EDTA，1 mmol／L 2-巯基乙醇)透析平衡，浓缩后备用。25 g Sephadex G75(Pharmacia)充分膨胀后装柱(90 cm×4.5 cm)，用D液平衡。上述蛋白浓缩液上样，上样体积为15 ml。以D液洗脱，流速为每分钟0.8 ml，部分收集器收集，每管5 ml。洗脱全过程出现3个蛋白吸收峰。将3峰液体分别收集、浓缩同前。