观察短链酰基辅酶A脱氢酶(SCAD)在人脐静脉内皮细胞(HUVEC)凋亡中的变化,探讨其与细胞凋亡的关系。
方法取正常培养2~3 d的HUVEC,采用叔丁基过氧化氢(tBHP)刺激HUVEC建立细胞凋亡模型,分别用0、10、20、30、40、50 μmol/L的tBHP干预HUVEC 12 h,用50 μmol/L的tBHP干预HUVEC 0、3、6、9、12 h,通过四甲基偶氮唑盐(MTT)比色法检测细胞活性、实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)和蛋白质免疫印迹试验(Western Blot)分别检测SCAD的mRNA及蛋白表达,以筛选tBHP干预HUVEC的最佳浓度和时间。用小干扰RNA(siRNA)干扰HUVEC的SCAD基因(siRNA274、siRNA414、siRNA679),通过检测SCAD mRNA和蛋白表达及SCAD酶活性,以筛选siRNA最佳干扰序列。然后以最佳干扰序列及tBHP同时干预HUVEC,通过检测细胞活性、细胞凋亡率、SCAD酶活性、SCAD mRNA和蛋白表达、活性氧(ROS)含量、三磷酸腺苷(ATP)含量和游离脂肪酸(FFA)含量,观察SCAD对HUVEC细胞凋亡的影响。
结果①随tBHP浓度增加及干预时间延长,细胞活性及SCAD mRNA和蛋白表达均逐渐降低,呈浓度和时间依赖性,以50 μmol/L tBHP干预HUVEC 12 h各指标下降最为显著。②在siRNA274、siRNA414、siRNA679 3条干扰序列中,siRNA679转染在降低SCAD mRNA和蛋白表达及酶活性方面最为显著。③与空白对照组相比,siRNA679干扰后细胞活性明显下降(A值:0.48±0.09比1.00±0.09,P<0.01),细胞凋亡率明显增加〔(29.96±2.09)%比(2.90±1.90)%,P<0.01〕,HUVEC中SCAD mRNA和蛋白表达、SCAD酶活性及ATP含量均显著下降〔SCAD mRNA(2-ΔΔCt):0.50±0.16比1.34±0.12,SCAD/α-Tubulin:0.67±0.11比1.00±0.06,SCAD酶活性(kU/g):0.38±0.04比0.53±0.04,ATP含量(μmol/g):0.14±0.02比0.19±0.01,均P<0.05〕,FFA及ROS含量显著增加〔FFA(nmol/g):0.84±0.07比0.47±0.04,ROS(平均荧光强度):647.5±23.7比434.2±46.5,均P<0.01〕。siRNA转染组各指标与tBHP诱导的HUVEC凋亡趋势一致。
结论SCAD表达失调可能参与HUVEC细胞凋亡过程,上调SCAD可能成为干预细胞凋亡的重要环节之一。