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【摘要】 目的：研究早发型（孕周<32周）及晚发型（孕周≥32周）子痫前期患者胎盘中NF-κB的活性强度。方法：选择子痫前期患者40例，其中早发型患者20例为早发型子痫前期组，晚发型患者20例为晚发型子痫前期组；正常足月妊娠孕妇30例为对照组。用免疫组化法观察各组胎盘NF-κBp65的分布和活性强度的差异。结果：子痫前期组胎盘NF-κBp65染色均较正常组明显增强，且早发型组较晚发型组染色明显增强，两组比较差异有统计学意义（P<0.05）。结论：早发型和晚发型子痫前期患者胎盘NF-κB活化增多，活性增强，及其所参与的免疫炎症反应，可能与其发病机制相关。
【关键词】 早发型及晚发型子痫前期； 核因子–κB； 胎盘
【Abstract】 Objective： To explore the relationship of NF-κB in placenta with early-onset （gestational age <32 weeks）and late-onset（gestational age ≥32 weeks）preeclampsia. Method：40 PE women were selected and divided into early-onset PE group of 20 cases and late-onset PE group of 20 cases.The normal control group were 30 healthy normotensive pregnancy.Immunohistochemistry was employed to show the location distribution and quantity of NF-κBp65 in placenta of preeclampsia. Result：NF–κBp65 in placenta of preeclampsia was stronger expression than that of control group，and was stronger expression in early-onset preeclampsia than that in late-onset preeclampsia，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion： It suggests that NF–κB participate in the pathogenesis of preeclampsia.Increasing NF–κB activity in placenta induces the immune inflammatory reaction，which may be related to the etiology of early-onset and late-onset preeclampsia.
【Key words】 Early-onset and late-onset preeclampsia； NF–κB； Placenta
First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou 350005，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.07.002
子痫前期是妊娠期特有并发症，严重影响母婴健康，基本病理变化是全身小血管痉挛，内皮细胞损伤及局部缺血，至今病因不明，因该病在胎盘娩出后常很快缓解或自愈，有学者称之为“胎盘病” [1]。故近年来围绕子痫前期胎盘病理的研究逐渐展开。目前，“炎症免疫过度激活”病因学说为多数学者认可。NF-κB是机体内重要的应激反应转录因子，在免疫炎症等一系列反应中扮演着重要的角色。本研究通过检测早发型及晚发型子痫前期患者胎盘组织中NF–κB的表达，探讨其在子痫前期发生发展中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2011年8月-2013年10月在福建医科大学附属第一医院妇产科分娩的孕产妇共70例，分为20例早发型子痫前期组（early-onset preeclampsia），20例晚发型子痫前期组（late-onset preeclampsia）（诊断标准参照人卫版《妇产科学》第8版），30例同期在福建医科大学附属第一医院产科分娩的正常孕妇为对照组（所有研究对象均无其他内外科合并症及并发症）。
1.2 方法
1.2.1 标本采集 胎盘娩出后取胎盘母体面1.0 cm×
1.0 cm×1.0 cm实质组织，10%福尔马林固定，24 h后脱水、透明、浸蜡、切片、编号保存。
1.2.2 免疫组织SP法 一抗为鼠抗人单克隆抗体NF-κBp65浓缩液，使用PV-9000试剂盒和DAB显色（均购于北京中杉生物技术公司），按试剂说明书操作，以PBS代替一抗作阴性对照。
1.2.3 结果判定 采用Image8000彩色图像分析仪进行图象采集分析，每张切片随机选取5个高倍视野（40倍），以阳性区进行平均光密度分析，以平均值表示胎盘组织内NF-κBp65的着色强度。
1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验和方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 胎盘NF-κBp65染色 胎盘中NF-κBp65主要表达于滋养细胞、血管内皮细胞、少量间质细胞胞浆及胞核内。本研究用免疫组化结果显示子痫前期患者胎盘绒毛血管及细小动脉内皮细胞胞浆、胞核NF-κBp65染色较正常妊娠胎盘组织明显增强，且早发型组染色强于晚发型组，见图1～3。以PBS代替一抗作阴性对照，见图4。 3 讨论
子痫前期（Preeclampsia）是妊娠期特有并发症，在妊娠中的发病率为7%～10%，在我国的发病率为9.4%[2]。近年来早发型子痫前期由于发病早、距离足月为时较远，母体病情发展快、并发症重、产后出血及脑血管意外发生率及病死率均增加，胎儿宫内生长受限、胎儿窘迫，新生儿孕周小、出生后并发症多、存活率低成为产科医生面临的难题[3-5]。至今为止，本病的发病机制尚未完全阐明。有学者提出子痫前期发病机制“两阶段”学说，第一阶段为临床前期，即子宫螺旋动脉滋养细胞重铸障碍，导致胎盘缺血、缺氧，释放多种胎盘因子；第二阶段胎盘因子进入母体血液循环，则促进系统性炎症反应的激活及血管内皮细胞损伤，引起子痫前期各种临床症状[6-8]。
核因子-κB（Nuclear factor–kappaB，NF-κB）是重要的一种广泛存在于组织和细胞中的转录调节因子，在机体的免疫应答及炎症反应等生理、病理过程中发挥重要作用[9-11]。典型的NF-κB是由p50和p65亚基形成的异二聚体。p65是其活性亚基，在细胞静止时，p65与IκBs结合位于细胞浆中，当细胞接受外来刺激后，p65与IκBs解聚，活化的NF-κB进入细胞核内，启动相关基因转录。故NF-κBp65免疫染色可反映NF-κB活性[12-13]。NF-κB可以诱导许多免疫炎症反应相关的基因转录，在免疫炎症反应中起重要作用。目前发现多数免疫炎症介质基因均受NF-κB调控，如肿瘤坏死因子、白细胞介素-6、极低密度脂蛋白等。而许多学者认为子痫前期患者无论是母胎界面局部还是全身均存在着炎症免疫反应过度激活现象。最新的研究显示，母胎界面局部处于主导地位的天然免疫系统在子痫前期发病机制中起重要作用，而TLR4（Toll样受体4）/NF-κB信号通路介导的免疫炎症反应在其中扮演着重要的角色[14]。胎儿是一个半移植物，成功的妊娠要求母体免疫系统对其充分耐受，现有的证据表明，子痫前期母体对胚胎免疫耐受降低，多种炎症免疫介质激活均可影响子宫螺旋小动脉重铸，造成胎盘浅着床，进而引起局部缺血及血管内皮损伤 [15-16]。
本研究用免疫组化结果显示子痫前期患者胎盘绒毛血管及细小动脉内皮细胞胞浆、胞核NF-κBp65染色较正常妊娠胎盘组织明显增强，且早发型组染色强于晚发型组。说明子痫前期患者胎盘NF-κB活化强度与病情严重程度成正相关，提示NF-κB激活与子痫前期的发生、发展有关。探讨其机制可能系子痫前期胎盘微小血管壁重构、胎盘血管炎症等病理过程与NF-κB的活化具有相关性：子痫前期胎盘滋养细胞浅着床，导致胎盘长期处于缺血缺氧状态，缺血缺氧信号促使NF-κBp65亚基与IκBs解聚，胞浆内NF-κB活化，进而移动至胞核内启动其下游一系列免疫炎症介质如肿瘤坏死因子-α、氧自由基和脂质过氧化物、极低密度脂蛋白、血管内皮生长因子、白细胞介素-6等的基因转录，使免疫炎症过度激活，形成级联炎症反应，导致胎儿-母体免疫平衡失调，从而依次引起子宫胎盘血管的发育受阻和免疫损伤，胎盘缺血，胎盘释放血浆细胞毒性因子增加，全身程度不同的血管内皮受损和多系统、多脏器的损伤，最终导致子痫前期的发生。
综上所述，NF-κB在子痫前期胎盘中的显著激活，及其所形成的后续免疫炎症级联反应，可能促进子痫前期，特别是早发型子痫前期的病理发生与发展。真正揭示早发型与晚发型子痫前期与NF-κB的关系，还有待大量深入的研究。
参考文献
[1] Maldonado-Perez D，Golightly E，Denison F C，et al. A role for lipoxin A4 as anti-inflammatory and proresolution mediator in human parturition[J].FASEB J，2011，25（2）：569-575.
[2] Siddiquil A，Jaleel A，Tamimi W，et al.Role of oxidative stress in the pathogenesis of preeclampsia[J].Arch Gynecol Obstet，2010，282（5）：469-474.
[3]彭晓华，彭晓清.妊娠期高血压的临床特点分析及对孕妇与围产儿的影响[J].中国医学创新，2011，8（11）：20-21.
[4]杨智，黄明媚，牛海艳，等.妊娠期高血压疾病患者血压与胎儿情况的相关性研究[J].中外医学研究，2014，12（6）：6-7.
[5]赵宇宏，范冰梅，张敏.重度子痫前期与胎儿宫内生长受限关系的临床研究[J].中国医学创新，2012，9（29）：61-62.
[6]谢幸，苟文丽.妇产科学[M].第8版.北京：人民卫生出版社，2013：64-71.
[7] Rajakumar A，Michael H M，Daftary A，et al.Proteasomal activity in placentas from women with preeclampsia and intrauterine growth restriction：implications for expression of HIF-alpha proteins[J].Placenta Mar，2008，29（3）：290-299.
[8] Yoav Yinon，Ori Nevo，Jing Xu，et al.Severe intrauterine growth restriction pregnancies have increased placental endoglin levels[J].The American Journal of Pathology，2008，84（172）：77-85. [9] Jeda M O， van’t Veer C，Fernandez Ortega C B，et al.Dialyzable leukocyte extract differentially regulates the production of TNF-alpha， IL-6， and IL-8 in bacterial component-activated leukocytes and endothelial cells[J].Inflamm Res，2005，54（2）：74-81.
[10] Kusunoki T，Sugai M，Gonda H，et al.CpG inhibits IgE class switch recombination through suppression of NF kappa B activity， but not through Id2 or Bcl6[J].Biochem Biophys Res Commun，2005，328 （2）：499-506.
[11] Sersam L W.Inflamatory markers in pre-eclampsia and related conditions[J].Int J Gynaecol Obstet，2009，105（1）：69-70.
[12] Flamant L，Toffoli S，Raes M，et al. Hypoxia regulates inflammatory gene expression in endothelial cells[J].Exp Cell Res，2009，315（5）： 733-747.
[13]王素梅，唐卉，苏莎，等.ALX-R在子痫前期患者胎盘组织中的表达及其与NF–κBp65的相关性[J].现代妇产科进展，2013，22（6）：477-480.
[14]王艳丽，张洁，裴素珍.Toll样受体和核转录因子-κB在子痫前期患者胎盘组织中的表达[J].中国医学创新，2014，11（10）：33-35.
[15] Rius J，Guma M，Schachtrup C，et al.NF-κB links innate immunity to the hypoxic response through transcriptional regulation of HIF-1α[J]. Nature，2008，453（7196）：807-811.
[16] Taylor C T，Cummins E P.The role of NF-kappaB in hypoxia-induced gene expression[J].Ann N Y Acad Sci，2009，155（1177）：178-184.
（收稿日期：2014-11-10） （本文编辑：周亚杰）
【关键词】 早发型及晚发型子痫前期； 核因子–κB； 胎盘
【Abstract】 Objective： To explore the relationship of NF-κB in placenta with early-onset （gestational age <32 weeks）and late-onset（gestational age ≥32 weeks）preeclampsia. Method：40 PE women were selected and divided into early-onset PE group of 20 cases and late-onset PE group of 20 cases.The normal control group were 30 healthy normotensive pregnancy.Immunohistochemistry was employed to show the location distribution and quantity of NF-κBp65 in placenta of preeclampsia. Result：NF–κBp65 in placenta of preeclampsia was stronger expression than that of control group，and was stronger expression in early-onset preeclampsia than that in late-onset preeclampsia，the differences were statistically significant（P<0.05）.Conclusion： It suggests that NF–κB participate in the pathogenesis of preeclampsia.Increasing NF–κB activity in placenta induces the immune inflammatory reaction，which may be related to the etiology of early-onset and late-onset preeclampsia.
【Key words】 Early-onset and late-onset preeclampsia； NF–κB； Placenta
First-author’s address：The First Affiliated Hospital of Fujian Medical University，Fuzhou 350005，China
doi：10.3969/j.issn.1674-4985.2015.07.002
子痫前期是妊娠期特有并发症，严重影响母婴健康，基本病理变化是全身小血管痉挛，内皮细胞损伤及局部缺血，至今病因不明，因该病在胎盘娩出后常很快缓解或自愈，有学者称之为“胎盘病” [1]。故近年来围绕子痫前期胎盘病理的研究逐渐展开。目前，“炎症免疫过度激活”病因学说为多数学者认可。NF-κB是机体内重要的应激反应转录因子，在免疫炎症等一系列反应中扮演着重要的角色。本研究通过检测早发型及晚发型子痫前期患者胎盘组织中NF–κB的表达，探讨其在子痫前期发生发展中的作用。
1 资料与方法
1.1 一般资料 选择2011年8月-2013年10月在福建医科大学附属第一医院妇产科分娩的孕产妇共70例，分为20例早发型子痫前期组（early-onset preeclampsia），20例晚发型子痫前期组（late-onset preeclampsia）（诊断标准参照人卫版《妇产科学》第8版），30例同期在福建医科大学附属第一医院产科分娩的正常孕妇为对照组（所有研究对象均无其他内外科合并症及并发症）。
1.2 方法
1.2.1 标本采集 胎盘娩出后取胎盘母体面1.0 cm×
1.0 cm×1.0 cm实质组织，10%福尔马林固定，24 h后脱水、透明、浸蜡、切片、编号保存。
1.2.2 免疫组织SP法 一抗为鼠抗人单克隆抗体NF-κBp65浓缩液，使用PV-9000试剂盒和DAB显色（均购于北京中杉生物技术公司），按试剂说明书操作，以PBS代替一抗作阴性对照。
1.2.3 结果判定 采用Image8000彩色图像分析仪进行图象采集分析，每张切片随机选取5个高倍视野（40倍），以阳性区进行平均光密度分析，以平均值表示胎盘组织内NF-κBp65的着色强度。
1.3 统计学处理 采用SPSS 16.0软件进行统计分析，计量资料以（x±s）表示，比较采用t检验和方差分析，以P<0.05为差异有统计学意义。
2 结果
2.1 胎盘NF-κBp65染色 胎盘中NF-κBp65主要表达于滋养细胞、血管内皮细胞、少量间质细胞胞浆及胞核内。本研究用免疫组化结果显示子痫前期患者胎盘绒毛血管及细小动脉内皮细胞胞浆、胞核NF-κBp65染色较正常妊娠胎盘组织明显增强，且早发型组染色强于晚发型组，见图1～3。以PBS代替一抗作阴性对照，见图4。 3 讨论
子痫前期（Preeclampsia）是妊娠期特有并发症，在妊娠中的发病率为7%～10%，在我国的发病率为9.4%[2]。近年来早发型子痫前期由于发病早、距离足月为时较远，母体病情发展快、并发症重、产后出血及脑血管意外发生率及病死率均增加，胎儿宫内生长受限、胎儿窘迫，新生儿孕周小、出生后并发症多、存活率低成为产科医生面临的难题[3-5]。至今为止，本病的发病机制尚未完全阐明。有学者提出子痫前期发病机制“两阶段”学说，第一阶段为临床前期，即子宫螺旋动脉滋养细胞重铸障碍，导致胎盘缺血、缺氧，释放多种胎盘因子；第二阶段胎盘因子进入母体血液循环，则促进系统性炎症反应的激活及血管内皮细胞损伤，引起子痫前期各种临床症状[6-8]。
核因子-κB（Nuclear factor–kappaB，NF-κB）是重要的一种广泛存在于组织和细胞中的转录调节因子，在机体的免疫应答及炎症反应等生理、病理过程中发挥重要作用[9-11]。典型的NF-κB是由p50和p65亚基形成的异二聚体。p65是其活性亚基，在细胞静止时，p65与IκBs结合位于细胞浆中，当细胞接受外来刺激后，p65与IκBs解聚，活化的NF-κB进入细胞核内，启动相关基因转录。故NF-κBp65免疫染色可反映NF-κB活性[12-13]。NF-κB可以诱导许多免疫炎症反应相关的基因转录，在免疫炎症反应中起重要作用。目前发现多数免疫炎症介质基因均受NF-κB调控，如肿瘤坏死因子、白细胞介素-6、极低密度脂蛋白等。而许多学者认为子痫前期患者无论是母胎界面局部还是全身均存在着炎症免疫反应过度激活现象。最新的研究显示，母胎界面局部处于主导地位的天然免疫系统在子痫前期发病机制中起重要作用，而TLR4（Toll样受体4）/NF-κB信号通路介导的免疫炎症反应在其中扮演着重要的角色[14]。胎儿是一个半移植物，成功的妊娠要求母体免疫系统对其充分耐受，现有的证据表明，子痫前期母体对胚胎免疫耐受降低，多种炎症免疫介质激活均可影响子宫螺旋小动脉重铸，造成胎盘浅着床，进而引起局部缺血及血管内皮损伤 [15-16]。
本研究用免疫组化结果显示子痫前期患者胎盘绒毛血管及细小动脉内皮细胞胞浆、胞核NF-κBp65染色较正常妊娠胎盘组织明显增强，且早发型组染色强于晚发型组。说明子痫前期患者胎盘NF-κB活化强度与病情严重程度成正相关，提示NF-κB激活与子痫前期的发生、发展有关。探讨其机制可能系子痫前期胎盘微小血管壁重构、胎盘血管炎症等病理过程与NF-κB的活化具有相关性：子痫前期胎盘滋养细胞浅着床，导致胎盘长期处于缺血缺氧状态，缺血缺氧信号促使NF-κBp65亚基与IκBs解聚，胞浆内NF-κB活化，进而移动至胞核内启动其下游一系列免疫炎症介质如肿瘤坏死因子-α、氧自由基和脂质过氧化物、极低密度脂蛋白、血管内皮生长因子、白细胞介素-6等的基因转录，使免疫炎症过度激活，形成级联炎症反应，导致胎儿-母体免疫平衡失调，从而依次引起子宫胎盘血管的发育受阻和免疫损伤，胎盘缺血，胎盘释放血浆细胞毒性因子增加，全身程度不同的血管内皮受损和多系统、多脏器的损伤，最终导致子痫前期的发生。
综上所述，NF-κB在子痫前期胎盘中的显著激活，及其所形成的后续免疫炎症级联反应，可能促进子痫前期，特别是早发型子痫前期的病理发生与发展。真正揭示早发型与晚发型子痫前期与NF-κB的关系，还有待大量深入的研究。
参考文献
[1] Maldonado-Perez D，Golightly E，Denison F C，et al. A role for lipoxin A4 as anti-inflammatory and proresolution mediator in human parturition[J].FASEB J，2011，25（2）：569-575.
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[7] Rajakumar A，Michael H M，Daftary A，et al.Proteasomal activity in placentas from women with preeclampsia and intrauterine growth restriction：implications for expression of HIF-alpha proteins[J].Placenta Mar，2008，29（3）：290-299.
[8] Yoav Yinon，Ori Nevo，Jing Xu，et al.Severe intrauterine growth restriction pregnancies have increased placental endoglin levels[J].The American Journal of Pathology，2008，84（172）：77-85. [9] Jeda M O， van’t Veer C，Fernandez Ortega C B，et al.Dialyzable leukocyte extract differentially regulates the production of TNF-alpha， IL-6， and IL-8 in bacterial component-activated leukocytes and endothelial cells[J].Inflamm Res，2005，54（2）：74-81.
[10] Kusunoki T，Sugai M，Gonda H，et al.CpG inhibits IgE class switch recombination through suppression of NF kappa B activity， but not through Id2 or Bcl6[J].Biochem Biophys Res Commun，2005，328 （2）：499-506.
[11] Sersam L W.Inflamatory markers in pre-eclampsia and related conditions[J].Int J Gynaecol Obstet，2009，105（1）：69-70.
[12] Flamant L，Toffoli S，Raes M，et al. Hypoxia regulates inflammatory gene expression in endothelial cells[J].Exp Cell Res，2009，315（5）： 733-747.
[13]王素梅，唐卉，苏莎，等.ALX-R在子痫前期患者胎盘组织中的表达及其与NF–κBp65的相关性[J].现代妇产科进展，2013，22（6）：477-480.
[14]王艳丽，张洁，裴素珍.Toll样受体和核转录因子-κB在子痫前期患者胎盘组织中的表达[J].中国医学创新，2014，11（10）：33-35.
[15] Rius J，Guma M，Schachtrup C，et al.NF-κB links innate immunity to the hypoxic response through transcriptional regulation of HIF-1α[J]. Nature，2008，453（7196）：807-811.
[16] Taylor C T，Cummins E P.The role of NF-kappaB in hypoxia-induced gene expression[J].Ann N Y Acad Sci，2009，155（1177）：178-184.
（收稿日期：2014-11-10） （本文编辑：周亚杰）