论文部分内容阅读
摘要： 葫芦素类是主要分布于葫芦科植物中具有多种医药活性的四环三萜类化合物，目前药用葫芦素原料主要从甜瓜蒂中提取。该研究从甜瓜中克隆葫芦素类合成关键酶——鲨烯合酶（SQS）的基因，并对其序列进行了生物信息学分析。结果表明：DNA测序和BLAST RefSeqGene分析表明，克隆的甜瓜SQS基因片段具有完整的该酶基因开放阅读框架（ORF）序列。ORF分析显示，甜瓜SQS由417氨基酸残基构成，等电点为7.56。对推衍的甜瓜SQS氨基酸序列分析结果提示，该酶二级结构以α螺旋为主。结构域预测结果表明，SQS属于异戊二烯合酶家族，具有法呢酰基二磷酸及镁离子的结合位点。三级结构预测提示，甜瓜SQS为单体酶，其活性中心主要由几个α螺旋围绕形成的穴状结构。磷酸化位点分析显示，S48处于酶活性中心相关47VSRSF52的模体中，而S196是正选择位点，提示这两处磷酸化位点可能是甜瓜SQS酶活性调节的关键部位。以甜瓜SQS基因ORF序列构建系统发生树的系统发生分类结果与形态学分类结果一致。该研究结果为葫芦素类的生物合成调控研究提供了新的线索和实验依据。
关键词： 甜瓜， 鲨烯合酶， 基因克隆， 序列分析
中图分类号： Q946.83
文献标识码： A
文章编号： 10003142（2017）03037308
Abstract： Cucurbitacins （Cus） are tetracyclic triterpenoid compounds which exist mainly in cucurbitaceous plants and have various pharmaceuticalslike actions. The medicinal raw materials of Cus are currently extracted mainly from the pedicellus melo. In this study， the gene of squalene synthase （SQS）， the key enzyme for Cus biosynthesis， from Cucumis melo was cloned， and the amino acid sequence of the enzyme derived from its nucleotide sequence was analyzed with bioinformatics methods. DNA sequencing and BLAST RefSeqGene analysis indicated that the cloned fragment of the C. melo SQS gene contained a complete open reading frame （ORF） of the gene. ORF Finder analysis showed that the SQS of C. melo was constituted of 417 amino acid residues with an isoelectric point of 7.56. Analysis of the deduced amino acid sequence suggested that the main type of secondary structure of the enzyme was α helix. Domain prediction study indicated that the SQS belonged to the isoprenoid biosynthase superfamily possessing the banding sites of farnesyl diphosphate and magnesian ion. Prediction of the tertiary structure suggested that the SQS was a monomeric enzyme with a cavelike activity center formed by α helixes. Protein phosphorylation analysis indicated that the phosphorylation site S48 located in the activity centerrelated motif 47 VSRSF52 and S196 was a positive selection site， suggesting that both S48 and S196 were critical sites for the regulation of SQS activity. The phylogenetic classification based on the phylogenetic tress constructed with the ORF sequence of the SQS gene showed that the result was in accordance with that of morphologic classification. Therefore， this study provides new clues and reference for research of the regulation of Cus biosynthesis.
Key words： Cucumis melo， squalene synthase， gene cloning， sequence analysis
葫蘆素类（Cucurbitacins， Cus）为一类主要分布于葫芦科植物中的四环三萜化合物，其抗炎、抗肿瘤和免疫调节活性具有重要医学价值（王莉梅和姚铭，2015）。植物体内包括Cus在内的三萜化合物主要通过甲羟戊酸途径（mevalonic acid pathway， MVA）合成。该途径以乙酰 CoA 为原料，经过一系列酶促反应生成金合欢基焦磷酸或法尼基焦磷酸 （farnesyl diphosphate， FPP）。2分子FPP 在鲨烯合酶（squalene synthase， SQS）催化下以尾尾方式连接生成鲨烯，后者经不同途径环合生成三萜化合物（Kim et al，2011）。SQS 处于萜类代谢途径中的FPP到其它产物的分支点上，是生物合成三萜化合物的一个关键酶。SQS的含量和活性直接影响到鲨烯的生物合成量，进而影响到三萜化合物的生物合成（吴耀生等， 2007）。 目前，三七、人参和红花栝楼等多种药用植物的SQS基因已被克隆（吴耀生等，2007；张明哲等，2010；陶晨陈等，2015）。然而，尽管药用葫芦素原料主要从甜瓜蒂中提取，但甜瓜SQS基因序列及酶分子结构尚未见文献报道。本研究从甜瓜叶中克隆了SQS基因开放阅读框架（open reading frame， ORF）及其3′末端序列，并对推衍的甜瓜SQS氨基酸序列进行了生物信息学分析。
1材料与方法
1.1 材料
甜瓜种为购自驻马店市志海种业有限公司2014年3月的甜瓜一代大田用种，将种子种于温室发芽至10 cm后，取其叶片保存至液氮中备用。Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自大连宝生物公司，3′Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase购自日本TaKaRa公司，2×Taq PCR MasterMix、核酸电泳Marker DL2000、质粒小提试剂盒和大肠杆菌DH5α购自于天根生化科技有限公司，异硫氰酸胍粉剂、Xgal、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒及引物购自上海生物工程股份有限公司，pGEMT Easy Vector连接试剂盒购自美国Promega公司。克隆测序由上海生物工程公司完成。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取及逆转录在陶晨陈等（2015）方法的基础上改进异硫氰酸胍法提取甜瓜叶片中的总RNA。取0.01～0.02 g叶片，剪成碎片置于2 mL冻存管中，放入液氮罐，过夜。次日取出冻存管，立即加入异硫氰酸胍提取缓冲液（4 mol·L1异硫氰酸胍，25 mmol·L1柠檬酸钠 pH7.0，0.5% 十二烷基肌氨酸钠，用前加β巯基乙醇至总浓度2%），用S10高速匀浆机（手提式高速分散器）匀浆。加入100 μL 2 mol·L1 NaAc （pH4.0）， 800 μL饱和酚，200 μL氯仿，漩涡振荡混匀，冰浴5 min，4 ℃ 15 000 r·min1 离心10 min。将上层水相转移入另一1.5 mL离心管中，加入2/3体积的5 mol·L1的KAc，混匀，冰浴5 min ，4 ℃ 15 000 r·min1离心10 min。将上层水相转移入另一1.5 mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀。-20 ℃冰浴5～10 min，4 ℃ 15 000 r·min1离心10 min。弃上清，70 %的乙醇洗沉淀后加入无RNA酶水溶解沉淀，-80 ℃保存备用。取1 μg总RNA，Oligo（dT）反转录后作为扩增甜瓜SQS的ORF的模板。取1 μg总RNA，按3′Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase说明书操作，反转录后用于扩增甜瓜SQS基因的3′末端序列。
1.2.2 甜瓜SQS基因部分片段的扩增及3′端序列的扩增参照NCBI上GenBank中其它葫芦科植物SQS序列中的高度保守序列，设计引物P1：5′ACAACAACGTTGAAGTCTTCAGGGG3′，P2：5′CGGTAACCGTTTGGCAGAGA3′，扩增甜瓜SQS基因部分片段，扩增长度为300 bp，扩增条件：94 ℃预变性10 min， 然后94 ℃变性30 s， 58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，运行40个循环，72 ℃延伸10 min。将扩增产物直接送上海生物工程有限公司测序证实所获序列为甜瓜SQS基因部分序列。根据测序结果设计甜瓜SQS基因3′末端内部特异性引物P3： 5′GGTCAACAGTGATCCTAATGC3′及外部特异性引物P4： 5′CGATTGCGGATGTCTATGGAGC3′。按3′Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase说明书操作并克隆甜瓜SQS 基因3′末端，将克隆菌液送上海生物工程有限公司测序证实所获序列为甜瓜SQS基因 3′末端序列。
1.2.3 甜瓜SQS基因 ORF的克隆鉴于SQS基因 5′末端高度保守，因此根據NCBI上GenBank中其它葫芦科植物SQS基因序列及上述操作获得的甜瓜SQS基因3′末端序列设计了扩增甜瓜SQS基因ORF的引物P5： 5′GATTGAGAGCGAGAAATGGG3′；P6：5′TCATACAGATTGGTTGGCTG3′，扩增条件为94 ℃预变性10 min；94 ℃ 60 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35个循环，最后72 ℃延伸4 min。将扩增产物胶回收后，按美国Promega公司的pGEMT Easy Vector试剂盒克隆甜瓜SQS基因ORF，将获得的质粒送上海生物工程有限公司测序。
1.2.4 生物信息学分析将获得的甜瓜SQS基因序列置NCBI上，以ORF Finder （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）寻找ORF，应用DNASTAR将获得的ORF序列翻译为氨基酸序列，以ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）及ProtParam（http：//web.expasy.org/cgibin/protparam/protparam）分析甜瓜SQS蛋白的疏水性/亲水性，NetPhos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）对蛋白质磷酸化位点进行预测。以DNASTART软件中的protean以及在线网站NPS@（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_seccons.htm）分析其二级结构；结构域预测在NCBI CDSearch（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）网站上进行。以TMHMM Server v. 2.0分析其跨膜区。 通过SWISS-MODEL软件对甜瓜SQS蛋白质的三级结构进行预测，用RASTOP 2.0软件编辑。
从GenBank中下载植物SQS基因，布朗葡萄藻为outgroup，以clustalx1.8对已报道的絞股蓝、香瓜、黄瓜、人参、丹参、拟南芥、甘草、番茄、马铃薯、烟草、玉米等物种的SQS氨基酸序列进行比对分析，并构建了系统进化树， 在MEGA5.0软件上进行UPGMA算法，并进行1 000次的Bootstrap 测试。
2结果与分析
2.1 甜瓜总RNA提取结果
提取的甜瓜叶子总RNA用紫外分光光度计检测的A260/280值均在1.8～2.0之间，A260/230值也都大于2.0，且琼脂糖凝胶电泳显示，28SrRNA与18SrRNA的亮度接近2∶1，提示所提取的总RNA质量良好。
2.2 甜瓜SQS基因的扩增结果
参照NCBI上GenBank中其它葫芦科植物SQS基因序列中的高度保守序列，设计引物了P1及P2，扩增了甜瓜SQS基因部分片段，扩增长度与预期相符，测序列结果在NCBI的BLAST RefSeqGene上比对提示获得SQS基因部分序列。按3′Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase说明书克隆甜瓜SQS基因 3′末端，扩增结果与预期相符。
2.3 甜瓜SQS 基因的克隆
根据获得的序列设计扩增甜瓜SQS基因ORF的引物P5和P6扩增出甜瓜SQS基因ORF片段，结果与预期相符。将PCR产物克隆入pGEMT Easy 载体中，测序结果在NCBI的BLAST RefSeqGene上比对提示获得甜瓜SQS基因ORF序列。
2.4 生物信息学分析
2.4.1 甜瓜SQS核苷酸序列分析将获得的甜瓜基因序列上传至NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） Analyz中的ORF Finder工具对甜瓜SQS基因ORF 核苷酸序列进行分析，结果提示甜瓜SQS基因ORF编码417个氨基酸，等电点为7.56。将甜瓜SQS基因ORF与其它植物SQS基因进行核苷酸序列比对构建系统树，显示系统发生分类结果与形态学分类结果一致（图1）。
2.4.2 甜瓜SQS氨基酸序列分析结合NCBI中的ORF Finder工具以及DNASTART软件将甜瓜SQS 基因ORF 核苷酸序列推衍出其氨基酸序列，甜瓜SQS与葫芦科其它植物氨基酸序列比对。图2显示，与酶活性中心相关的47VSRSF52、Y70、R74、R77DTVED81、Y164、G202、L205、212RDYLED217、R225均高度保守。NetPhos2.0 Server分析提示甜瓜SQS共有17个磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸化位点6个，分别为S48、S196、S249、S281、S358、S407。苏氨酸磷酸化位点6个，分别为 T78、T83、T144、T161、T318、T327。酪氨酸磷酸化位点5个，分别为 Y165、Y236、Y245、Y273、Y387。ProtParam分析结果提示，甜瓜SQS为亲水性蛋白，多肽链中包含50个碱性氨基酸、49个酸性氨基酸。极性氨基酸100个，疏水性氨基酸159个，GRAVY值为-0.065。
2.4.3 甜瓜SQS蛋白质结构生物信息学分析二级结构分析提示，该蛋白的二级结构中α螺旋占64.99%，延伸主链占7.19%，无规则卷曲占27.82%，甜瓜SQS主要由α螺旋构成（图4：A）。结构域预测结果提示，甜瓜SQS氨蛋白质属于异戊二烯合酶家族，具结合法呢酰基二磷酸及镁离子的结合位点，以及富含天冬氨酸模体（图4：B）。跨膜区分析提示，甜瓜SQS具两个跨膜区，分别为282到304氨基酸之间及386到408氨基酸之间，1到281氨基酸及409到417氨基酸位于膜外侧，305到385氨基酸位于膜内侧。
三级结构预测提示，甜瓜SQS为单体蛋白结构（图5），结合文献（Pandit et al，2000；侯嵘等，2011），其活性中心主要由几个α螺旋围绕形成一穴状活性中心结构，其17个磷酸化位点均位于蛋白质的表面。
3讨论
SQS是葫芦科植物Cus生物合成的关键酶，其细胞定位于内质网膜（Pandit et al；殷秀梅等，2012）。尽管药用Cus原料主要来自甜瓜，但目前对甜瓜SQS的结构与功能仍不清楚。本研究基于克隆的甜瓜SQS基因ORF推导出甜瓜SQS氨基酸序列。序列分析结果提示，甜瓜SQS是由417氨基酸残基构成的单体酶，二级结构以α螺旋占为主。其活性中心为主要由几个α螺旋围绕形成的穴状结构。该酶有两段跨膜区，分别位于282到304及386到408氨基酸残基之间，是酶蛋白锚定于内质网膜上的肽段。1到281及409到417氨基酸残基的肽段位于酶蛋白的内质网膜外侧，其中包括与酶活性中心相关的47VSRSF52、Y70、R74、77DTVED81、Y164、G202、L205、212RDYLED217和R225等保守序列。这些肽段和氨基酸残基的分布特点应与酶的催化功能相适应。
序列分析发现，一些磷酸化位点可能是甜瓜SQS活性调节的关键部位。该酶共有17个磷酸化位点，均位于蛋白质的表面。其中S48、S196、S249、S281、T78、T83、T144、T161，Y165、Y236、Y245和Y273 12个磷酸化位点位于酶蛋白的内质网膜外侧，S358、T318和T327 3个磷酸化位点位于酶蛋白的内质网内侧，S407
和Y387 2个磷酸化位点位于酶蛋白的跨膜区。位于酶蛋白的内质网外侧的12个磷酸化位点可能参与酶的活性调节。特别是S48恰好位于与酶活性中心相关47VSRSF52模体中，因而提示其可能是酶活性调节的一个关键性磷酸化位点。此外，在陆生SQS中目前已发现21个正选择位点，分别为Q33、Q59、E133、S189、S194、S196、I265、K278、V381、R382、S383、E384、P385、I386、P389、T390、A408、R410、F411、P412和N414（刘墉等，2013）。其中S196分布于甜瓜SQS表面并位于酶蛋白的内质网膜外侧，因此，正选择位点S196可能是该酶活性调节的另一个关键性磷酸化位点。
以甜瓜SQS基因 ORF序列构建系统发生树得到系统发生分类结果与形态学分类结果一致，表明甜瓜等陆生植物的SQS基因构建系统发生树可以较好地反映不同物种间的亲缘关系。推衍的甜瓜SQS氨基酸序列与其它植物比对结果显示，该酶不具备特征性的氨基酸位点。葫芦科植物SQS与其他植物SQS的氨基酸序列比对显示，葫芦科植物SQS氨基酸序列也不具备特征性的氨基酸位点。
总之，本研究克隆了葫芦科植物甜瓜SQS基因，并应用生物信息学方法分析甜瓜SQS分子结构特点，发现该酶磷酸化位点S48和S196可能是酶活性调节的关键位点。这些结果为SQS酶活性和Cus生物合成调节研究提供了新的线索和实验依据。
参考文献：
HOU R， GONG NX， LIU FT， 2011. Cloning and bioinformatics analysis of squalene synthase gene （SQS） from Jatropha curcas L. [J]. J Trop Subtrop Bot， 19（5）： 391-399. [侯嵘，龚诺希，
关键词： 甜瓜， 鲨烯合酶， 基因克隆， 序列分析
中图分类号： Q946.83
文献标识码： A
文章编号： 10003142（2017）03037308
Abstract： Cucurbitacins （Cus） are tetracyclic triterpenoid compounds which exist mainly in cucurbitaceous plants and have various pharmaceuticalslike actions. The medicinal raw materials of Cus are currently extracted mainly from the pedicellus melo. In this study， the gene of squalene synthase （SQS）， the key enzyme for Cus biosynthesis， from Cucumis melo was cloned， and the amino acid sequence of the enzyme derived from its nucleotide sequence was analyzed with bioinformatics methods. DNA sequencing and BLAST RefSeqGene analysis indicated that the cloned fragment of the C. melo SQS gene contained a complete open reading frame （ORF） of the gene. ORF Finder analysis showed that the SQS of C. melo was constituted of 417 amino acid residues with an isoelectric point of 7.56. Analysis of the deduced amino acid sequence suggested that the main type of secondary structure of the enzyme was α helix. Domain prediction study indicated that the SQS belonged to the isoprenoid biosynthase superfamily possessing the banding sites of farnesyl diphosphate and magnesian ion. Prediction of the tertiary structure suggested that the SQS was a monomeric enzyme with a cavelike activity center formed by α helixes. Protein phosphorylation analysis indicated that the phosphorylation site S48 located in the activity centerrelated motif 47 VSRSF52 and S196 was a positive selection site， suggesting that both S48 and S196 were critical sites for the regulation of SQS activity. The phylogenetic classification based on the phylogenetic tress constructed with the ORF sequence of the SQS gene showed that the result was in accordance with that of morphologic classification. Therefore， this study provides new clues and reference for research of the regulation of Cus biosynthesis.
Key words： Cucumis melo， squalene synthase， gene cloning， sequence analysis
葫蘆素类（Cucurbitacins， Cus）为一类主要分布于葫芦科植物中的四环三萜化合物，其抗炎、抗肿瘤和免疫调节活性具有重要医学价值（王莉梅和姚铭，2015）。植物体内包括Cus在内的三萜化合物主要通过甲羟戊酸途径（mevalonic acid pathway， MVA）合成。该途径以乙酰 CoA 为原料，经过一系列酶促反应生成金合欢基焦磷酸或法尼基焦磷酸 （farnesyl diphosphate， FPP）。2分子FPP 在鲨烯合酶（squalene synthase， SQS）催化下以尾尾方式连接生成鲨烯，后者经不同途径环合生成三萜化合物（Kim et al，2011）。SQS 处于萜类代谢途径中的FPP到其它产物的分支点上，是生物合成三萜化合物的一个关键酶。SQS的含量和活性直接影响到鲨烯的生物合成量，进而影响到三萜化合物的生物合成（吴耀生等， 2007）。 目前，三七、人参和红花栝楼等多种药用植物的SQS基因已被克隆（吴耀生等，2007；张明哲等，2010；陶晨陈等，2015）。然而，尽管药用葫芦素原料主要从甜瓜蒂中提取，但甜瓜SQS基因序列及酶分子结构尚未见文献报道。本研究从甜瓜叶中克隆了SQS基因开放阅读框架（open reading frame， ORF）及其3′末端序列，并对推衍的甜瓜SQS氨基酸序列进行了生物信息学分析。
1材料与方法
1.1 材料
甜瓜种为购自驻马店市志海种业有限公司2014年3月的甜瓜一代大田用种，将种子种于温室发芽至10 cm后，取其叶片保存至液氮中备用。Taq DNA聚合酶和T4 DNA连接酶购自大连宝生物公司，3′Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase购自日本TaKaRa公司，2×Taq PCR MasterMix、核酸电泳Marker DL2000、质粒小提试剂盒和大肠杆菌DH5α购自于天根生化科技有限公司，异硫氰酸胍粉剂、Xgal、SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒及引物购自上海生物工程股份有限公司，pGEMT Easy Vector连接试剂盒购自美国Promega公司。克隆测序由上海生物工程公司完成。
1.2 方法
1.2.1 总RNA提取及逆转录在陶晨陈等（2015）方法的基础上改进异硫氰酸胍法提取甜瓜叶片中的总RNA。取0.01～0.02 g叶片，剪成碎片置于2 mL冻存管中，放入液氮罐，过夜。次日取出冻存管，立即加入异硫氰酸胍提取缓冲液（4 mol·L1异硫氰酸胍，25 mmol·L1柠檬酸钠 pH7.0，0.5% 十二烷基肌氨酸钠，用前加β巯基乙醇至总浓度2%），用S10高速匀浆机（手提式高速分散器）匀浆。加入100 μL 2 mol·L1 NaAc （pH4.0）， 800 μL饱和酚，200 μL氯仿，漩涡振荡混匀，冰浴5 min，4 ℃ 15 000 r·min1 离心10 min。将上层水相转移入另一1.5 mL离心管中，加入2/3体积的5 mol·L1的KAc，混匀，冰浴5 min ，4 ℃ 15 000 r·min1离心10 min。将上层水相转移入另一1.5 mL离心管中，加入等体积的异丙醇，混匀。-20 ℃冰浴5～10 min，4 ℃ 15 000 r·min1离心10 min。弃上清，70 %的乙醇洗沉淀后加入无RNA酶水溶解沉淀，-80 ℃保存备用。取1 μg总RNA，Oligo（dT）反转录后作为扩增甜瓜SQS的ORF的模板。取1 μg总RNA，按3′Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase说明书操作，反转录后用于扩增甜瓜SQS基因的3′末端序列。
1.2.2 甜瓜SQS基因部分片段的扩增及3′端序列的扩增参照NCBI上GenBank中其它葫芦科植物SQS序列中的高度保守序列，设计引物P1：5′ACAACAACGTTGAAGTCTTCAGGGG3′，P2：5′CGGTAACCGTTTGGCAGAGA3′，扩增甜瓜SQS基因部分片段，扩增长度为300 bp，扩增条件：94 ℃预变性10 min， 然后94 ℃变性30 s， 58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸30 s，运行40个循环，72 ℃延伸10 min。将扩增产物直接送上海生物工程有限公司测序证实所获序列为甜瓜SQS基因部分序列。根据测序结果设计甜瓜SQS基因3′末端内部特异性引物P3： 5′GGTCAACAGTGATCCTAATGC3′及外部特异性引物P4： 5′CGATTGCGGATGTCTATGGAGC3′。按3′Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase说明书操作并克隆甜瓜SQS 基因3′末端，将克隆菌液送上海生物工程有限公司测序证实所获序列为甜瓜SQS基因 3′末端序列。
1.2.3 甜瓜SQS基因 ORF的克隆鉴于SQS基因 5′末端高度保守，因此根據NCBI上GenBank中其它葫芦科植物SQS基因序列及上述操作获得的甜瓜SQS基因3′末端序列设计了扩增甜瓜SQS基因ORF的引物P5： 5′GATTGAGAGCGAGAAATGGG3′；P6：5′TCATACAGATTGGTTGGCTG3′，扩增条件为94 ℃预变性10 min；94 ℃ 60 s，58 ℃ 30 s，72 ℃ 90 s，35个循环，最后72 ℃延伸4 min。将扩增产物胶回收后，按美国Promega公司的pGEMT Easy Vector试剂盒克隆甜瓜SQS基因ORF，将获得的质粒送上海生物工程有限公司测序。
1.2.4 生物信息学分析将获得的甜瓜SQS基因序列置NCBI上，以ORF Finder （http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/gorf/gorf.html）寻找ORF，应用DNASTAR将获得的ORF序列翻译为氨基酸序列，以ProtScale（http：//web.expasy.org/protscale/）及ProtParam（http：//web.expasy.org/cgibin/protparam/protparam）分析甜瓜SQS蛋白的疏水性/亲水性，NetPhos 2.0 Server（http：//www.cbs.dtu.dk/services/NetPhos/）对蛋白质磷酸化位点进行预测。以DNASTART软件中的protean以及在线网站NPS@（https：//npsaprabi.ibcp.fr/cgibin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_seccons.htm）分析其二级结构；结构域预测在NCBI CDSearch（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi）网站上进行。以TMHMM Server v. 2.0分析其跨膜区。 通过SWISS-MODEL软件对甜瓜SQS蛋白质的三级结构进行预测，用RASTOP 2.0软件编辑。
从GenBank中下载植物SQS基因，布朗葡萄藻为outgroup，以clustalx1.8对已报道的絞股蓝、香瓜、黄瓜、人参、丹参、拟南芥、甘草、番茄、马铃薯、烟草、玉米等物种的SQS氨基酸序列进行比对分析，并构建了系统进化树， 在MEGA5.0软件上进行UPGMA算法，并进行1 000次的Bootstrap 测试。
2结果与分析
2.1 甜瓜总RNA提取结果
提取的甜瓜叶子总RNA用紫外分光光度计检测的A260/280值均在1.8～2.0之间，A260/230值也都大于2.0，且琼脂糖凝胶电泳显示，28SrRNA与18SrRNA的亮度接近2∶1，提示所提取的总RNA质量良好。
2.2 甜瓜SQS基因的扩增结果
参照NCBI上GenBank中其它葫芦科植物SQS基因序列中的高度保守序列，设计引物了P1及P2，扩增了甜瓜SQS基因部分片段，扩增长度与预期相符，测序列结果在NCBI的BLAST RefSeqGene上比对提示获得SQS基因部分序列。按3′Full RACE Core Set with PrimeScriptTM RTase说明书克隆甜瓜SQS基因 3′末端，扩增结果与预期相符。
2.3 甜瓜SQS 基因的克隆
根据获得的序列设计扩增甜瓜SQS基因ORF的引物P5和P6扩增出甜瓜SQS基因ORF片段，结果与预期相符。将PCR产物克隆入pGEMT Easy 载体中，测序结果在NCBI的BLAST RefSeqGene上比对提示获得甜瓜SQS基因ORF序列。
2.4 生物信息学分析
2.4.1 甜瓜SQS核苷酸序列分析将获得的甜瓜基因序列上传至NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） Analyz中的ORF Finder工具对甜瓜SQS基因ORF 核苷酸序列进行分析，结果提示甜瓜SQS基因ORF编码417个氨基酸，等电点为7.56。将甜瓜SQS基因ORF与其它植物SQS基因进行核苷酸序列比对构建系统树，显示系统发生分类结果与形态学分类结果一致（图1）。
2.4.2 甜瓜SQS氨基酸序列分析结合NCBI中的ORF Finder工具以及DNASTART软件将甜瓜SQS 基因ORF 核苷酸序列推衍出其氨基酸序列，甜瓜SQS与葫芦科其它植物氨基酸序列比对。图2显示，与酶活性中心相关的47VSRSF52、Y70、R74、R77DTVED81、Y164、G202、L205、212RDYLED217、R225均高度保守。NetPhos2.0 Server分析提示甜瓜SQS共有17个磷酸化位点，其中丝氨酸磷酸化位点6个，分别为S48、S196、S249、S281、S358、S407。苏氨酸磷酸化位点6个，分别为 T78、T83、T144、T161、T318、T327。酪氨酸磷酸化位点5个，分别为 Y165、Y236、Y245、Y273、Y387。ProtParam分析结果提示，甜瓜SQS为亲水性蛋白，多肽链中包含50个碱性氨基酸、49个酸性氨基酸。极性氨基酸100个，疏水性氨基酸159个，GRAVY值为-0.065。
2.4.3 甜瓜SQS蛋白质结构生物信息学分析二级结构分析提示，该蛋白的二级结构中α螺旋占64.99%，延伸主链占7.19%，无规则卷曲占27.82%，甜瓜SQS主要由α螺旋构成（图4：A）。结构域预测结果提示，甜瓜SQS氨蛋白质属于异戊二烯合酶家族，具结合法呢酰基二磷酸及镁离子的结合位点，以及富含天冬氨酸模体（图4：B）。跨膜区分析提示，甜瓜SQS具两个跨膜区，分别为282到304氨基酸之间及386到408氨基酸之间，1到281氨基酸及409到417氨基酸位于膜外侧，305到385氨基酸位于膜内侧。
三级结构预测提示，甜瓜SQS为单体蛋白结构（图5），结合文献（Pandit et al，2000；侯嵘等，2011），其活性中心主要由几个α螺旋围绕形成一穴状活性中心结构，其17个磷酸化位点均位于蛋白质的表面。
3讨论
SQS是葫芦科植物Cus生物合成的关键酶，其细胞定位于内质网膜（Pandit et al；殷秀梅等，2012）。尽管药用Cus原料主要来自甜瓜，但目前对甜瓜SQS的结构与功能仍不清楚。本研究基于克隆的甜瓜SQS基因ORF推导出甜瓜SQS氨基酸序列。序列分析结果提示，甜瓜SQS是由417氨基酸残基构成的单体酶，二级结构以α螺旋占为主。其活性中心为主要由几个α螺旋围绕形成的穴状结构。该酶有两段跨膜区，分别位于282到304及386到408氨基酸残基之间，是酶蛋白锚定于内质网膜上的肽段。1到281及409到417氨基酸残基的肽段位于酶蛋白的内质网膜外侧，其中包括与酶活性中心相关的47VSRSF52、Y70、R74、77DTVED81、Y164、G202、L205、212RDYLED217和R225等保守序列。这些肽段和氨基酸残基的分布特点应与酶的催化功能相适应。
序列分析发现，一些磷酸化位点可能是甜瓜SQS活性调节的关键部位。该酶共有17个磷酸化位点，均位于蛋白质的表面。其中S48、S196、S249、S281、T78、T83、T144、T161，Y165、Y236、Y245和Y273 12个磷酸化位点位于酶蛋白的内质网膜外侧，S358、T318和T327 3个磷酸化位点位于酶蛋白的内质网内侧，S407
和Y387 2个磷酸化位点位于酶蛋白的跨膜区。位于酶蛋白的内质网外侧的12个磷酸化位点可能参与酶的活性调节。特别是S48恰好位于与酶活性中心相关47VSRSF52模体中，因而提示其可能是酶活性调节的一个关键性磷酸化位点。此外，在陆生SQS中目前已发现21个正选择位点，分别为Q33、Q59、E133、S189、S194、S196、I265、K278、V381、R382、S383、E384、P385、I386、P389、T390、A408、R410、F411、P412和N414（刘墉等，2013）。其中S196分布于甜瓜SQS表面并位于酶蛋白的内质网膜外侧，因此，正选择位点S196可能是该酶活性调节的另一个关键性磷酸化位点。
以甜瓜SQS基因 ORF序列构建系统发生树得到系统发生分类结果与形态学分类结果一致，表明甜瓜等陆生植物的SQS基因构建系统发生树可以较好地反映不同物种间的亲缘关系。推衍的甜瓜SQS氨基酸序列与其它植物比对结果显示，该酶不具备特征性的氨基酸位点。葫芦科植物SQS与其他植物SQS的氨基酸序列比对显示，葫芦科植物SQS氨基酸序列也不具备特征性的氨基酸位点。
总之，本研究克隆了葫芦科植物甜瓜SQS基因，并应用生物信息学方法分析甜瓜SQS分子结构特点，发现该酶磷酸化位点S48和S196可能是酶活性调节的关键位点。这些结果为SQS酶活性和Cus生物合成调节研究提供了新的线索和实验依据。
参考文献：
HOU R， GONG NX， LIU FT， 2011. Cloning and bioinformatics analysis of squalene synthase gene （SQS） from Jatropha curcas L. [J]. J Trop Subtrop Bot， 19（5）： 391-399. [侯嵘，龚诺希，