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摘要：该试验通过对天津市部分地区种公猪常温精液的抽样调查，分别对所采样品进行细菌培养，最终利用全自动微生物分析系统仪对所培养的细菌分离鉴定。该次试验共检测出3种细菌，分别是埃希氏菌属大肠杆菌、肠道球菌属粪链球菌及粘质沙雷菌。
关键词：常温种公猪精液;细菌培养;分离鉴定
中图分类号：S852.6
文献标识码：B
doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.22.003
0引言
猪的人工授精技术在我国于20世纪60-70年代已广泛开展，经过不断研究，目前此项技术已较为完善，大幅度提高优秀种公猪的利用率，并且在一定程度上减少了疫病传播。但是常温保存下的种公猪精液很容易滋生细菌等微生物，这些微生物很有可能导致精液质量下降，直接影响母猪受胎率[1]。因此种公猪常温精液中细菌的分离鉴定對精液的保存及利用也是至关重要的。
1试验准备
1.1仪器
恒温培养箱（品牌：博讯;型号：GSP-9050MBE）;生物安全柜（品牌：力康;型号：Hfsafe-1500A2）;生物显微镜（品牌：奥林帕斯;型号：BX43）;高压灭菌器（品牌：博讯;型号：YXQ-0LS-50SII）;医用常温冰箱（品牌：海尔;型号：HY°C-260）;全自动微生物分析系统仪（品牌：BiomerieuxsaFrance;型号：VITEK2 compact）
1.2材料
培养基（普通营养琼脂培养基、血液琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基）;革兰氏阴性菌鉴定卡;革兰氏阳性菌鉴定卡;营养肉汤;革兰氏染色套装;酒精灯;接种环等。
2试验步骤
2.1样品准备
（1）分4次共抽取不同种公猪、不同时间的100份种公猪常温精液作为样品，每次获得样品数量25份。
（2）将抽取的样品保存在精液保存箱中，在精液管上标注好采样时间及所取种公猪的耳标号。
2.2细菌培养及提纯
（1）每次试验在25份样品中随机抽取5份种公猪常温精液，摇匀，取普通营养琼脂10个（每个样品接种2个），用无菌接种环挑取精液样本，均匀涂抹在培养基上;盖好皿盖，标记好接种时间，所取样品的耳标号（每个耳标号接种2份）;然后将普通营养琼脂平板倒置放入37°C的细菌恒温培养箱中培养24～48h。见图1、图2。
（2）24～48h后，从原始的培养皿中依次挑取一半的单一菌落，依次在琼脂培养基平板中划线接种。然后将平皿盖盖好，用高压过的记号笔写下接种时间、菌种来源，倒置放人恒温培养箱中培养。按照此方法操作，直到将样品接种培养基上的所有菌落分离，得到单一纯化菌种。见图3、图4。
（3）将选取待检菌落，同时挑取剩下半个单一检菌落接种在营养肉汤中培养18～24h。在肉汤管上，标记好接种时间、菌种来源，以备待用。
（4）采用革兰氏染色方法，对分离到的微生物菌落进行涂片染色，观察菌体的形态和结构，判断其阴阳性。
（5）利用全自动微生物分析系统仪对待检细菌进行鉴定。
2.3细菌鉴定
利用自动微生物分析系统仪对样品进行鉴定，得到鉴定结果。
2.4常温精液鉴定
其余95份常温精液样品，依照2.2、2.3步骤进行鉴定。
3结果与分析
本次试验共检测出3种细菌，按照细菌的生长特点、染色后的镜检结果，以及微生物分析系统的鉴定报告，现已确定分离出的细菌种类为3种，分别是埃希氏菌属大肠杆菌、肠道球菌属粪链球菌及粘质沙雷菌。其中大肠杆菌和粪链球菌均为肠道内常驻菌，而粘质沙雷菌可存在于尿道中。见图5。
4讨论与结论
猪精液中微生物有动物性和非动物性2种来源，第1种主要是由于公猪发生疾病，病原微生物是病毒感染生殖道或其他组织所致。第2种污染来源主要来自于收集精液，即采精过程，精液暴露于环境中受环境微生物侵染[2]。本次所检测的对象来源均为正规种公猪场，皆有严格的疫苗接种及疫病监护手段，同时从检测结果分析，所检出的3种细菌所占比例均不超过10%，故可暂且不考虑动物自身带有疾病的可能，当然若需明确排除，还要进一步辅助检测手段。
市场上销售的稀释剂中普遍添加有抑菌效果的抗生素类药物，比较常见的有氨基糖甙类、林可酰胺类和乳胺类抗生素[3]，所以稀释后的常温种公猪精液应该是无菌的，但从检测出大肠杆菌的结果进行分析，在实际使用中依然存在微生物在稀释精液中大量存在，并且生长繁殖生命活动可以正常进行，或者在短时间可以达到抑菌作用，但保存时间达到2～3d后微生物抑制效果就已衰弱的现象，究其原因可能是添加的抗生素类药物对感染精液的微生物不敏感。因此，应定期对常温种公猪精液进行细菌检测，通过药敏试验筛选出抑菌效果好的抗生素。
检测出粪链球菌的样品中均为检测出大肠杆菌这一试验结果，可推测出粪链球菌可能具有抑制大肠杆菌的作用;而粘质沙雷氏菌的检出，不排除采集精液时有尿液混人的可能，因此建议应严格控制采精流程，提高采精人员的技术水平，以免精液在采集过程中受到污染。
参考文献
[1]张家庆，伏彭辉，毛献宝，等.公猪精液中细菌的分离鉴定及药敏试验[J].养猪，2009（6）：55-56.
[2]金穗华，刘源远，许国林，等.公猪精液中细菌种类及药敏试验[J].养猪，1994（1）：19-20.
[3]孙晓军，滚双宝、猪精液常温保存稀释液筛选试验[J].甘肃畜牧兽医，2010，40（4）：13-15.
关键词：常温种公猪精液;细菌培养;分离鉴定
中图分类号：S852.6
文献标识码：B
doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.22.003
0引言
猪的人工授精技术在我国于20世纪60-70年代已广泛开展，经过不断研究，目前此项技术已较为完善，大幅度提高优秀种公猪的利用率，并且在一定程度上减少了疫病传播。但是常温保存下的种公猪精液很容易滋生细菌等微生物，这些微生物很有可能导致精液质量下降，直接影响母猪受胎率[1]。因此种公猪常温精液中细菌的分离鉴定對精液的保存及利用也是至关重要的。
1试验准备
1.1仪器
恒温培养箱（品牌：博讯;型号：GSP-9050MBE）;生物安全柜（品牌：力康;型号：Hfsafe-1500A2）;生物显微镜（品牌：奥林帕斯;型号：BX43）;高压灭菌器（品牌：博讯;型号：YXQ-0LS-50SII）;医用常温冰箱（品牌：海尔;型号：HY°C-260）;全自动微生物分析系统仪（品牌：BiomerieuxsaFrance;型号：VITEK2 compact）
1.2材料
培养基（普通营养琼脂培养基、血液琼脂培养基、麦康凯琼脂培养基）;革兰氏阴性菌鉴定卡;革兰氏阳性菌鉴定卡;营养肉汤;革兰氏染色套装;酒精灯;接种环等。
2试验步骤
2.1样品准备
（1）分4次共抽取不同种公猪、不同时间的100份种公猪常温精液作为样品，每次获得样品数量25份。
（2）将抽取的样品保存在精液保存箱中，在精液管上标注好采样时间及所取种公猪的耳标号。
2.2细菌培养及提纯
（1）每次试验在25份样品中随机抽取5份种公猪常温精液，摇匀，取普通营养琼脂10个（每个样品接种2个），用无菌接种环挑取精液样本，均匀涂抹在培养基上;盖好皿盖，标记好接种时间，所取样品的耳标号（每个耳标号接种2份）;然后将普通营养琼脂平板倒置放入37°C的细菌恒温培养箱中培养24～48h。见图1、图2。
（2）24～48h后，从原始的培养皿中依次挑取一半的单一菌落，依次在琼脂培养基平板中划线接种。然后将平皿盖盖好，用高压过的记号笔写下接种时间、菌种来源，倒置放人恒温培养箱中培养。按照此方法操作，直到将样品接种培养基上的所有菌落分离，得到单一纯化菌种。见图3、图4。
（3）将选取待检菌落，同时挑取剩下半个单一检菌落接种在营养肉汤中培养18～24h。在肉汤管上，标记好接种时间、菌种来源，以备待用。
（4）采用革兰氏染色方法，对分离到的微生物菌落进行涂片染色，观察菌体的形态和结构，判断其阴阳性。
（5）利用全自动微生物分析系统仪对待检细菌进行鉴定。
2.3细菌鉴定
利用自动微生物分析系统仪对样品进行鉴定，得到鉴定结果。
2.4常温精液鉴定
其余95份常温精液样品，依照2.2、2.3步骤进行鉴定。
3结果与分析
本次试验共检测出3种细菌，按照细菌的生长特点、染色后的镜检结果，以及微生物分析系统的鉴定报告，现已确定分离出的细菌种类为3种，分别是埃希氏菌属大肠杆菌、肠道球菌属粪链球菌及粘质沙雷菌。其中大肠杆菌和粪链球菌均为肠道内常驻菌，而粘质沙雷菌可存在于尿道中。见图5。
4讨论与结论
猪精液中微生物有动物性和非动物性2种来源，第1种主要是由于公猪发生疾病，病原微生物是病毒感染生殖道或其他组织所致。第2种污染来源主要来自于收集精液，即采精过程，精液暴露于环境中受环境微生物侵染[2]。本次所检测的对象来源均为正规种公猪场，皆有严格的疫苗接种及疫病监护手段，同时从检测结果分析，所检出的3种细菌所占比例均不超过10%，故可暂且不考虑动物自身带有疾病的可能，当然若需明确排除，还要进一步辅助检测手段。
市场上销售的稀释剂中普遍添加有抑菌效果的抗生素类药物，比较常见的有氨基糖甙类、林可酰胺类和乳胺类抗生素[3]，所以稀释后的常温种公猪精液应该是无菌的，但从检测出大肠杆菌的结果进行分析，在实际使用中依然存在微生物在稀释精液中大量存在，并且生长繁殖生命活动可以正常进行，或者在短时间可以达到抑菌作用，但保存时间达到2～3d后微生物抑制效果就已衰弱的现象，究其原因可能是添加的抗生素类药物对感染精液的微生物不敏感。因此，应定期对常温种公猪精液进行细菌检测，通过药敏试验筛选出抑菌效果好的抗生素。
检测出粪链球菌的样品中均为检测出大肠杆菌这一试验结果，可推测出粪链球菌可能具有抑制大肠杆菌的作用;而粘质沙雷氏菌的检出，不排除采集精液时有尿液混人的可能，因此建议应严格控制采精流程，提高采精人员的技术水平，以免精液在采集过程中受到污染。
参考文献
[1]张家庆，伏彭辉，毛献宝，等.公猪精液中细菌的分离鉴定及药敏试验[J].养猪，2009（6）：55-56.
[2]金穗华，刘源远，许国林，等.公猪精液中细菌种类及药敏试验[J].养猪，1994（1）：19-20.
[3]孙晓军，滚双宝、猪精液常温保存稀释液筛选试验[J].甘肃畜牧兽医，2010，40（4）：13-15.