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摘要：利用Kan处理甜瓜种子、幼苗，选择不同品种、不同时期Kan临界浓度。对花粉管通道法转化的甜瓜种子进行早期筛选。结果表明，鲁薄1号甜瓜(薄皮)对Kan反应较乌克兰、雪里华甜瓜(厚皮)敏感，种子较幼苗敏感，子叶承受的Kan压力是种子的3～4倍。子叶涂抹法是较适宜的筛选方法。PCR及Southern杂交检测证明，Kan对大量转化甜瓜种子进行早期筛选是可行的。
关键词：转基因甜瓜 Kan 早期筛选 PCR
蔬菜作物转基因研究已在国内外广泛开展。研究过程中为了便于选择转化植株，通常在构建基因表达载体时插入遗传标记基因，如Gus、cat、NPT－II、gfp、pat、荧光素酶基因、冠瘿碱合成酶基因及二氢叶酸还原酶基因等，其中NPT－II基因应用最为广泛。使用NPT－II基因转化植物。可以使植物细胞产生对卡那霉素(Kanamycin，以下简称Kan)等抗生素的较大抗性，植株能够正常生长。
利用花粉管通道法能够收获大量“转化”种子。单纯依靠实验室的分子检测耗资大、时间长。因此，迫切需要建立一种与花粉管转化相适应的早期筛选技术。目前。Kan已经应用于转基因棉花、小麦早期筛选及田间检测，大量分子证据验证了Kan检测的可靠性。由于植物自身对Kan敏感性不同，且同一植物的不同发育时期对Kan抗性也存在差异。因此，研究甜瓜对Kan处理的反应，选择有效I临界浓度，可为大量“转化”种子早期快速筛选提供依据，加快花粉管通道技术在甜瓜基因转化中的应用。
1、材料与方法
1.1试验材料
受体甜瓜：乌克兰(厚皮)、雪里华(网纹)、鲁薄1号(薄皮)3个高代低糖自交系及相应的花粉管通道法转化种子，由山东省农业科学院蔬菜研究所甜瓜课题组提供。供体质粒：携带Npt－II、Anti－MAI基因。由山东大学生命科学院赵双宜、于喜艳教授提供。Kan：硫酸阿米卡星注射液由齐鲁制药厂有限公司生产，产品批号0508171，20万单位/支。NPT－II引物由上海生工生物工程公司合成。
P1：5’－GGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGC－3’，P2：5’－TGCCGACCATCTGTTGTYTGCCC－3’。TaKaRaTaqTM、λEcoTl4 I购自TaKaRa公司。Southern分析DIG High Primer DNA Labeling and Dectection StarterKit II(Cat No.11585614910)购自Roche DiagnosticsGmbh。Germany。HybondTM－N 尼龙膜购自AmershanPhamacia公司。其他为常规分析纯试剂。
1.2试验设计
1.2.1试验浓度种子：Kan质量浓度0～1500 mg/L，每100mg/L设置1个浓度梯度，0mg/L为对照(CK)。叶片：Kan质量浓度0～8000mg/L，每500mg/L设置1个浓度梯度，0mg/L为对照(CK)。
1.2.2处理方法涂抹法：毛笔在Kan液中浸透，均匀涂抹1片子叶、半片真叶正面：连续重复处理3次。浸润法：脱脂棉团成小球，在Kan液中浸透。摆在叶片正面，为防止棉球滑落，用透明胶固定，3d后拿掉。喷雾法：幼苗2叶1心时用小型喷雾器均匀向苗床喷雾，保证雾流细、匀。连续重复处理3次。
1.2.3调查方法挑选整齐饱满的普通甜瓜种子，每个材料每个浓度均为100粒。在Kan溶液中浸种，30℃恒温黑暗条件下催芽。3～4d后统计种子萌发及根系生长情况。田间播种，调查出苗率、绿苗率。
普通种子常规浸种催芽。播种于单孔穴盘，幼苗子叶完全展平及真叶如贰分硬币大小时，挑选生长一致的幼苗进行Kan处理。连续重复处理3次，每个处理每个重复50株，7 d后调查子叶反应。调查标准参阅祝建波等人的方法。
0级：叶片正常。
1级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色略有差异，但不明显，叶色仍为绿色。
2级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色对比加深，差异较明显，叶色变浅。
3级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色差异明显。叶色由绿转黄。
4级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色差异极明显，叶色由黄逐步转白。
5级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色差异极明显，叶色由白逐步转褐，并稍有破损。
6级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色差异极明显，叶色基本变褐。破损极为严重。
1.3转化种子的筛选
每个品种、每个处理随机取500粒花粉管通道法转化的甜瓜种子，使用Kan临界浓度处理种子、幼苗，提取Kan 绿苗的基因组DNA，进行PCR及Southern杂交检测。
2、结果与分析
2.1Kan处理方法比较
涂抹法、浸润法、喷雾法处理甜瓜幼苗，各品种表现黄斑趋势一样。涂抹叶片黄斑面积较大，但颜色深浅有差异，特别是处理真叶，叶尖、主叶脉部位黄斑重；浸润法黄斑明显。斑迹与脱脂球形状相同，同样浓度黄斑颜色深、明显：喷雾法黄斑呈随机点状，表现不均匀、不明显，增加了调查误差。3种方法相比较，以涂抹法较好，操作简单，处理结果清晰，易调查。
2.2Kan处理种子临界浓度筛选
甜瓜种子在不同浓度Kan溶液中均能萌发，但下胚轴、胚根发育差异明显。超过一定浓度时，处理种子的下胚轴粗短，主根无任何侧根、根毛，随浓度加大差异更明显，且根尖变褐、腐烂。播种到田间后，Kan处理过的种子出土晚。随浓度增加出苗率、绿苗率降低，生长速度减慢，出土时间延长甚至不出土。由此可见。Kan不影响种子萌发，但却明显抑制芽、根系生长，这可作为一项易于鉴定转化后代的指示性状。表1表明，本试验选用的3个甜瓜自交系Kan压力有差异，Kan浓度为1100、800、600mg/L时，乌克兰、雪里华、鲁薄1号的绿苗率为0，Kan已将普通种子杀死，可确定为种子有效临界致死浓度。
2.3Kan处理幼苗临界浓度筛选
Kan对叶片伤害依次表现为黄化、白化、干枯、破损。1、2级反应可能是植株自身对Kan存在一定抗性，进行转化植株检测会增加假阳性，影响选择效果；6级反应筛选压力过强，造成转化植株呈Kan阴性而逃逸。3～5级反应基本消除了植株本身对Kan处理的负面效应，可作为临界筛选的标准。5级黄化指数为83.3％，因此以指数接近80％的Kan浓度作为临界。表2结果表明，乌克兰宜选用4000mg/L、雪里华选用5000mg/L、鲁薄1号选用2500mg/L作为子叶临界选择压；真叶对Kan反应比子叶敏感， 3个试材的真叶临界浓度分别为3500、5000～5500、2000mg/L。
另外，Kan处理甜瓜后的调查数据表明，3个材料的种子、幼苗对Kan反应呈一定正相关性，即种子接受Kan压力高。幼苗临界选择压相应较高，幼苗承受Kan压力比种子高3～4倍。田间试验发现，Kan处理过的甜瓜种子，虽然能较早筛选到绿苗。但后期部分植株无生长点，停留在1片或2片真叶甚至只有2片子叶状态，无法进行后续研究。而处理真叶后Kan药液易集留并沿叶柄流到生长点，也影响植株后期生长。因此。在实际应用研究中。处理子叶较为理想。
2.4花粉管转化甜瓜种子的田间筛选与分子检测
使用Kan临界选择压处理3个甜瓜转化种子、幼苗，结果见表3。乌克兰、雪里华2个厚皮甜瓜真叶筛选后的绿苗率均高于种子、子叶处理，而鲁薄1号筛选种子、子叶的绿苗率高于真叶。Kan 绿苗的PCR检测结果表明，3个自交系的Kan检测准确率以种子处理最高，子叶次之，真叶处理最低。因此，3个甜瓜真叶、子叶的Kan临界质量浓度可适当提高。
3、讨论与结论
Kan对转基因植物进行筛选实质上是通过Kan抗性基因NPT－II起作用的。Kan与植物细胞器中的核糖体30S亚基结合，阻止翻译过程，干扰蛋白质合成。导致植物细胞死亡。NPT－II利用ATP的KP使Kan的某个特定羟基发生磷酸化，抑制Kan与核糖体相结合。植物叶片叶绿体等器官正常生长，无NPT-H基因的叶片失绿黄化。NPT-H作为标记基因一般与目的基因连锁在一起。Kan处理植株后。若保持绿色，则认为目的基因已被转入。本试验根据此原理，利用适宜Kan临界浓度筛选转化携带NPT－II的Anti－MAI基因的甜瓜种子、幼苗。可以直观地在早期筛选出转化株，大大减少后期工作量。
很多研究证实利用Kan对转基因后代进行筛选是切实可行的，可应用于筛选转化后代外源基因遗传分离规律、转基因种子纯度、田间转基因成株的筛选等。此方法简单快速、经济高效，检测结果可靠，适用于生产试验上的大面积应用。由于不同植物对Kan敏感性差异较大。使用时期、方法、浓度、环境条件等因素均影响转化植株的筛选效率。因此，Kan临界浓度的选择是一个动态的过程，确定最佳选择浓度是提高Kan筛选效率的关键问题。
本试验结果表明，3个甜瓜自交系对Kan处理反应有差异，鲁薄1号(薄皮)较乌克兰、雪里华(厚皮)对Kan敏感性强。种子、幼苗对Kan抗性反应有一定相关性。即种子Kan选择压高，子叶相应表现出较高Kan抗性。甜瓜不同发育时期对Kan抗性水平不同，种子发芽期最敏感，较低浓度便产生致死，真叶次之，子叶Kan致死浓度最高。该结果与祝建波等人的研究结果一致。临界浓度Kan筛选甜瓜转化种子后，Kan 绿苗能够得到PCR阳性谱带及Southern杂交信号。因此，利用Kan对大量转化甜瓜种子筛选能够较快较早地筛选到转化植株。
关键词：转基因甜瓜 Kan 早期筛选 PCR
蔬菜作物转基因研究已在国内外广泛开展。研究过程中为了便于选择转化植株，通常在构建基因表达载体时插入遗传标记基因，如Gus、cat、NPT－II、gfp、pat、荧光素酶基因、冠瘿碱合成酶基因及二氢叶酸还原酶基因等，其中NPT－II基因应用最为广泛。使用NPT－II基因转化植物。可以使植物细胞产生对卡那霉素(Kanamycin，以下简称Kan)等抗生素的较大抗性，植株能够正常生长。
利用花粉管通道法能够收获大量“转化”种子。单纯依靠实验室的分子检测耗资大、时间长。因此，迫切需要建立一种与花粉管转化相适应的早期筛选技术。目前。Kan已经应用于转基因棉花、小麦早期筛选及田间检测，大量分子证据验证了Kan检测的可靠性。由于植物自身对Kan敏感性不同，且同一植物的不同发育时期对Kan抗性也存在差异。因此，研究甜瓜对Kan处理的反应，选择有效I临界浓度，可为大量“转化”种子早期快速筛选提供依据，加快花粉管通道技术在甜瓜基因转化中的应用。
1、材料与方法
1.1试验材料
受体甜瓜：乌克兰(厚皮)、雪里华(网纹)、鲁薄1号(薄皮)3个高代低糖自交系及相应的花粉管通道法转化种子，由山东省农业科学院蔬菜研究所甜瓜课题组提供。供体质粒：携带Npt－II、Anti－MAI基因。由山东大学生命科学院赵双宜、于喜艳教授提供。Kan：硫酸阿米卡星注射液由齐鲁制药厂有限公司生产，产品批号0508171，20万单位/支。NPT－II引物由上海生工生物工程公司合成。
P1：5’－GGCAGCGCGGCTATCGTGGCTGGC－3’，P2：5’－TGCCGACCATCTGTTGTYTGCCC－3’。TaKaRaTaqTM、λEcoTl4 I购自TaKaRa公司。Southern分析DIG High Primer DNA Labeling and Dectection StarterKit II(Cat No.11585614910)购自Roche DiagnosticsGmbh。Germany。HybondTM－N 尼龙膜购自AmershanPhamacia公司。其他为常规分析纯试剂。
1.2试验设计
1.2.1试验浓度种子：Kan质量浓度0～1500 mg/L，每100mg/L设置1个浓度梯度，0mg/L为对照(CK)。叶片：Kan质量浓度0～8000mg/L，每500mg/L设置1个浓度梯度，0mg/L为对照(CK)。
1.2.2处理方法涂抹法：毛笔在Kan液中浸透，均匀涂抹1片子叶、半片真叶正面：连续重复处理3次。浸润法：脱脂棉团成小球，在Kan液中浸透。摆在叶片正面，为防止棉球滑落，用透明胶固定，3d后拿掉。喷雾法：幼苗2叶1心时用小型喷雾器均匀向苗床喷雾，保证雾流细、匀。连续重复处理3次。
1.2.3调查方法挑选整齐饱满的普通甜瓜种子，每个材料每个浓度均为100粒。在Kan溶液中浸种，30℃恒温黑暗条件下催芽。3～4d后统计种子萌发及根系生长情况。田间播种，调查出苗率、绿苗率。
普通种子常规浸种催芽。播种于单孔穴盘，幼苗子叶完全展平及真叶如贰分硬币大小时，挑选生长一致的幼苗进行Kan处理。连续重复处理3次，每个处理每个重复50株，7 d后调查子叶反应。调查标准参阅祝建波等人的方法。
0级：叶片正常。
1级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色略有差异，但不明显，叶色仍为绿色。
2级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色对比加深，差异较明显，叶色变浅。
3级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色差异明显。叶色由绿转黄。
4级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色差异极明显，叶色由黄逐步转白。
5级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色差异极明显，叶色由白逐步转褐，并稍有破损。
6级：叶片处理部位叶色与周边正常叶色差异极明显，叶色基本变褐。破损极为严重。
1.3转化种子的筛选
每个品种、每个处理随机取500粒花粉管通道法转化的甜瓜种子，使用Kan临界浓度处理种子、幼苗，提取Kan 绿苗的基因组DNA，进行PCR及Southern杂交检测。
2、结果与分析
2.1Kan处理方法比较
涂抹法、浸润法、喷雾法处理甜瓜幼苗，各品种表现黄斑趋势一样。涂抹叶片黄斑面积较大，但颜色深浅有差异，特别是处理真叶，叶尖、主叶脉部位黄斑重；浸润法黄斑明显。斑迹与脱脂球形状相同，同样浓度黄斑颜色深、明显：喷雾法黄斑呈随机点状，表现不均匀、不明显，增加了调查误差。3种方法相比较，以涂抹法较好，操作简单，处理结果清晰，易调查。
2.2Kan处理种子临界浓度筛选
甜瓜种子在不同浓度Kan溶液中均能萌发，但下胚轴、胚根发育差异明显。超过一定浓度时，处理种子的下胚轴粗短，主根无任何侧根、根毛，随浓度加大差异更明显，且根尖变褐、腐烂。播种到田间后，Kan处理过的种子出土晚。随浓度增加出苗率、绿苗率降低，生长速度减慢，出土时间延长甚至不出土。由此可见。Kan不影响种子萌发，但却明显抑制芽、根系生长，这可作为一项易于鉴定转化后代的指示性状。表1表明，本试验选用的3个甜瓜自交系Kan压力有差异，Kan浓度为1100、800、600mg/L时，乌克兰、雪里华、鲁薄1号的绿苗率为0，Kan已将普通种子杀死，可确定为种子有效临界致死浓度。
2.3Kan处理幼苗临界浓度筛选
Kan对叶片伤害依次表现为黄化、白化、干枯、破损。1、2级反应可能是植株自身对Kan存在一定抗性，进行转化植株检测会增加假阳性，影响选择效果；6级反应筛选压力过强，造成转化植株呈Kan阴性而逃逸。3～5级反应基本消除了植株本身对Kan处理的负面效应，可作为临界筛选的标准。5级黄化指数为83.3％，因此以指数接近80％的Kan浓度作为临界。表2结果表明，乌克兰宜选用4000mg/L、雪里华选用5000mg/L、鲁薄1号选用2500mg/L作为子叶临界选择压；真叶对Kan反应比子叶敏感， 3个试材的真叶临界浓度分别为3500、5000～5500、2000mg/L。
另外，Kan处理甜瓜后的调查数据表明，3个材料的种子、幼苗对Kan反应呈一定正相关性，即种子接受Kan压力高。幼苗临界选择压相应较高，幼苗承受Kan压力比种子高3～4倍。田间试验发现，Kan处理过的甜瓜种子，虽然能较早筛选到绿苗。但后期部分植株无生长点，停留在1片或2片真叶甚至只有2片子叶状态，无法进行后续研究。而处理真叶后Kan药液易集留并沿叶柄流到生长点，也影响植株后期生长。因此。在实际应用研究中。处理子叶较为理想。
2.4花粉管转化甜瓜种子的田间筛选与分子检测
使用Kan临界选择压处理3个甜瓜转化种子、幼苗，结果见表3。乌克兰、雪里华2个厚皮甜瓜真叶筛选后的绿苗率均高于种子、子叶处理，而鲁薄1号筛选种子、子叶的绿苗率高于真叶。Kan 绿苗的PCR检测结果表明，3个自交系的Kan检测准确率以种子处理最高，子叶次之，真叶处理最低。因此，3个甜瓜真叶、子叶的Kan临界质量浓度可适当提高。
3、讨论与结论
Kan对转基因植物进行筛选实质上是通过Kan抗性基因NPT－II起作用的。Kan与植物细胞器中的核糖体30S亚基结合，阻止翻译过程，干扰蛋白质合成。导致植物细胞死亡。NPT－II利用ATP的KP使Kan的某个特定羟基发生磷酸化，抑制Kan与核糖体相结合。植物叶片叶绿体等器官正常生长，无NPT-H基因的叶片失绿黄化。NPT-H作为标记基因一般与目的基因连锁在一起。Kan处理植株后。若保持绿色，则认为目的基因已被转入。本试验根据此原理，利用适宜Kan临界浓度筛选转化携带NPT－II的Anti－MAI基因的甜瓜种子、幼苗。可以直观地在早期筛选出转化株，大大减少后期工作量。
很多研究证实利用Kan对转基因后代进行筛选是切实可行的，可应用于筛选转化后代外源基因遗传分离规律、转基因种子纯度、田间转基因成株的筛选等。此方法简单快速、经济高效，检测结果可靠，适用于生产试验上的大面积应用。由于不同植物对Kan敏感性差异较大。使用时期、方法、浓度、环境条件等因素均影响转化植株的筛选效率。因此，Kan临界浓度的选择是一个动态的过程，确定最佳选择浓度是提高Kan筛选效率的关键问题。
本试验结果表明，3个甜瓜自交系对Kan处理反应有差异，鲁薄1号(薄皮)较乌克兰、雪里华(厚皮)对Kan敏感性强。种子、幼苗对Kan抗性反应有一定相关性。即种子Kan选择压高，子叶相应表现出较高Kan抗性。甜瓜不同发育时期对Kan抗性水平不同，种子发芽期最敏感，较低浓度便产生致死，真叶次之，子叶Kan致死浓度最高。该结果与祝建波等人的研究结果一致。临界浓度Kan筛选甜瓜转化种子后，Kan 绿苗能够得到PCR阳性谱带及Southern杂交信号。因此，利用Kan对大量转化甜瓜种子筛选能够较快较早地筛选到转化植株。