目的了解湖北省大流行期和流行后期新甲型H1N1流感病毒在流行分布、基因进化、抗原表位和耐药位点等方面的差异情况。方法对2009-2014年湖北省大流行期和流行后期新甲型H1N1流感病毒血凝素和神经氨酸酶的系统进化树、进化速率和氨基酸突变位点进行对比分析。结果大流行期病毒核酸阳性率大于流行后期,但大流行期病毒血凝素和神经氨酸酶基因进化速率均小于流行后期,且神经氨酸酶进化速率在两个时期都大于血凝素。血凝素抗原表位突变位点K163Q、A186T、S185T和S203T在大流行期与流行后期病毒的分布数和位置存在不同偏嗜,流行期鲜有的H275Y耐药位点在流行后期的三株病毒中被发现。结论流行后期的新甲型H1N1流感病毒进化速率不断提高,抗原表位和神经氨酸酶抑制剂耐药位点不断积累,防控工作愈加严峻,需进一步加强该病毒基因特性和耐药分析的监测。