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摘要：利用乙醇浸提法提取雪松松针中的黄酮类化合物，以芦丁为对照品，采用NaAc-AlCl3比色法考察总黄酮提取率，通过单因素试验和正交试验对提取工艺进行优化。结果表明，该方法的最佳提取工艺为：以1 g松针为原料，按照1∶45的料液比加入50%乙醇作为提取剂，于75℃恒温回流提取2 h。最佳工艺条件下雪松松针的总黄酮提取率为3.64%，RSD为4.04%。该方法稳定可靠，工艺合理可行。
关键词：雪松松针；总黄酮；分光光度法；工艺优化
中图分类号：S789.4文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）09-0120-04
松针富含多种营养成分[1]，具有解毒、提高人体免疫力等作用，在医药、卫生保健等方面存在巨大的开发利用价值[2，3]。目前，对雪松松针的研究主要集中在对其挥发油类、黄酮类成分的分析上[4]，缺乏对其提取工艺的系统研究。本试验着重对雪松松针中总黄酮的最佳提取工艺进行研究，以期为雪松松针总黄酮的大规模提取及其产品的深加工提供可行性依据。
1材料与方法
1.1材料與仪器
雪松松针，采自青岛农业大学；芦丁标准品，上海鼎杰生物科技有限公司；无水乙醇、结晶三氯化铝、乙酸钠、60～90℃石油醚等，均为分析纯。
UV-1601型紫外分光光度计，日本岛津公司；AR1140电子天平，上海奥斯豪国际工贸公司；KDM电子调温电热套，龙口市先科仪器公司；双列六孔电热恒温水浴锅，龙口市先科仪器公司；C30孔玻璃仪器气流烘干器， 郑州长城科工贸有限公司；SHB-B88循环水式真空泵，郑州长城科工贸有限公司。
1.2试验方法
1.2.1松针样品的前处理由于叶绿素等油溶性杂质易溶于石油醚[5]，而黄酮不溶于石油醚[6]，因此本试验采用石油醚浸提法对松针样品进行前处理，以除去叶绿素等油溶性杂质。
1.2.2提取工艺最优参数的确定以总黄酮提取率为评价指标，采用单因素试验，依次对乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比进行试验，以确定各因素最优值。在此基础上，采用四因素三水平正交试验进行进一步的工艺优化。
1.2.3总黄酮提取率的测定①标准曲线制作：天然产物中总黄酮含量的测定通常是以芦丁为标准品通过紫外可见分光光度法进行的[7]。本试验以芦丁为标准品，绘制标准曲线。方法为：准确移取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、5.00 mL芦丁标准品溶液于25 mL容量瓶，加入70%乙醇10.00 mL稀释，准确移入0.1 mol/L AlCl3 溶液2.00 mL、1.00 mol/L NaAc溶液3.00 mL，用70%乙醇定容至刻度摇匀，显色25 min，于282 nm波长下测定其吸光度，以标准品浓度（C）对吸光度（A）进行线性回归，所得标准曲线方程为：A=0.0068+28.66724×C，R=0.9998，线性关系良好（见图1）。
②松针样品总黄酮的测定：准确称取1 g松针待测样于250 mL烧瓶中，回流提取，冷却30 min，过滤，滤液定容至100 mL容量瓶。按照上述方法测定吸光度，根据公式求得总黄酮提取率。
2结果与分析
2.1松针样品前处理效果
由图2可以看出，经石油醚浸提后的吸收曲线（B）更加平缓，杂质峰明显减少，低波长处吸收峰的覆盖率降低，282 nm处出现了新的吸收峰，
峰型平缓，表明石油醚浸提除杂效果显著。
2.2单因素试验结果与分析
2.2.1乙醇浓度对总黄酮提取率的影响控制体系温度为75℃、料液比为1∶35、提取时间为3 h，设置不同的乙醇浓度对雪松松针中总黄酮进行提取，结果（图3）显示，随着乙醇浓度的增大，提取率先升高后降低，乙醇浓度为50%时提取率最高。因此，选取乙醇浓度40%、50%、60%三水平进行正交试验。
2.2.2浸提温度对总黄酮提取率的影响控制料液比为1∶35、提取时间3 h、乙醇浓度70%，设置不同的体系温度回流提取雪松松针中的总黄酮，结果（图4）表明，随着温度的升高，提取率逐渐升高至85℃时提取率最高，后略有降低。天然产物的提取过程中，温度对提取效果的影响较为复杂。松针中含有较多种类的活性物质，在不同温度下，会发生一些化学反应而降低黄酮含量[8]。较高的温度不但容易导致部分黄酮的分解[9]，而且不符合低能耗的原则，因此，选择 65、75、85℃为正交试验提取温度的三个水平。
2.2.3料液比对总黄酮提取率的影响控制体系温度为75℃、提取时间为3 h、乙醇浓度为70%，设置不同的料液比回流提取雪松松针中的总黄酮，结果（图5）表明，料液比为1∶45时总黄酮提取率最高。因此，选取1∶25、1∶35、1∶45为正交试验料液比的三个水平。
2.2.4提取时间对提取率的影响控制体系温度为75℃、乙醇浓度为70%、料液比为1∶35，改变松针中总黄酮的浸提时间，结果（图6）表明，回流提取时间为3 h时，黄酮提取率最高。因此，选取2、3、4 h为正交试验提取时间的三个水平。
2.3正交试验结果与分析
在单因素试验的基础上，进行四因素三水平正交试验，研究浸提温度、提取时间、料液比和乙醇浓度对雪松松针中总黄酮提取率的影响，结果（表1）显示，各因素对总黄酮提取率的影响顺序是：浸提温度>料液比>乙醇浓度>提取时间；各因素最优组合为：浸提温度75℃，料液比1∶45，乙醇浓度50%，提取时间3～4 h。因提取时间对总黄酮提取率的影响最小，且提取时间过长不仅会影响黄酮的稳定性，还会降低其提取效率，为节能降耗、提高效率，最终确定提取时间为2 h。
综上所述，雪松松针中总黄酮提取的最佳工艺条件为：浸提温度75℃，料液比1∶45，乙醇浓度50%，提取时间2 h。 2.4验证试验
准确称取1 g松针待测样，置于250 mL烧瓶中，加入50%的乙醇45 mL，于75℃恒温水浴回流提取2 h，冷却30 min后过滤至100 mL容量瓶中，定容，得待测液。取2.00 mL待测液于25 mL容量瓶中，加入70 %的乙醇10.00 mL稀释，准确移入0.1 mol/L AlCl3 溶液2.00 mL、1.00 mol/L NaAc溶液3.00 mL，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，显色25 min，于282 nm波长下测定吸光度，计算总黄酮提取率。结果（表2） 表明，平均提取率为3.64%。虽与提取3～4 h相比，總黄酮提取率有所降低，但缩短了提取时间，提高了提取效率，降低了能耗，优化后的工艺条件有效可行。
3小结
本试验采用紫外分光光度法，以芦丁为标准品，以乙醇水溶液为提取剂，采用溶剂回流浸提法提取雪松松针中的总黄酮，并通过AlCl3-NaAc显色体系，在282 nm波长下测定总黄酮提取率。通过单因素试验和正交试验，确定了最佳提取工艺为：1 g雪松松针待测样，按照1∶45的料液比，加入50%乙醇为提取剂，保持温度为75℃回流提取2 h，所得总黄酮提取率为3.64%，RSD 4.04%。该提取工艺方法简单可行，效果稳定可靠。
参考文献：
[1]Liu D Y， Shi X F，Wang D D，et al. A new flavonoid in pine needles of Cedrus deodara[J]. Chinese Herbal Medicines， 2011， 3 （1）： 5-6.
[2]张志琴， 肖培云， 刘光明. 松针的化学成分和药理活性研究进展[J]. 现代药物与临床， 2011 （4）： 278-281.
[3]Vankar P S， Srivastava J. Comparative study of total phenol， flavonoid contents and antioxidant activity in Canna indica and Hibiscus rosa-sinensis： prospective natural food dyes[J]. International Journal of Food Engineering， 2008， 4 （3），DOI：10.2202/1556-3758.1232.
[4]刘东彦， 石晓峰， 李冲， 等. 雪松松针黄酮类化学成分的研究[J]. 中草药， 2011， 42（4）：631-633.
[5]马骏， 王超， 李秀妹， 等. 绿色植物色素的提取和色谱分离[J]. 化工时刊， 2009， 23（10）： 46-49.
[6]陈晓青，蒋新宇，刘佳佳. 中草药成分分离分析技术与方法[M]. 北京：化学工业出版社，2006.
[7]付煜荣， 姚荣章. 景天三七中总黄酮提取条件和含量分析[J]. 河北北方学院学报：医学版， 2010（1）：13-15.
[8]徐春生. 天然松针提取物在牙膏中的应用[J]. 牙膏工业， 2006（2）：23-25.
[9]李倩，钟玲，池汝安，等. 离子液体微波辅助提取葛根总黄酮[J]. 武汉工程大学学报， 2011， 33 （11）：31-34.
关键词：雪松松针；总黄酮；分光光度法；工艺优化
中图分类号：S789.4文献标识号：A文章编号：1001-4942（2014）09-0120-04
松针富含多种营养成分[1]，具有解毒、提高人体免疫力等作用，在医药、卫生保健等方面存在巨大的开发利用价值[2，3]。目前，对雪松松针的研究主要集中在对其挥发油类、黄酮类成分的分析上[4]，缺乏对其提取工艺的系统研究。本试验着重对雪松松针中总黄酮的最佳提取工艺进行研究，以期为雪松松针总黄酮的大规模提取及其产品的深加工提供可行性依据。
1材料与方法
1.1材料與仪器
雪松松针，采自青岛农业大学；芦丁标准品，上海鼎杰生物科技有限公司；无水乙醇、结晶三氯化铝、乙酸钠、60～90℃石油醚等，均为分析纯。
UV-1601型紫外分光光度计，日本岛津公司；AR1140电子天平，上海奥斯豪国际工贸公司；KDM电子调温电热套，龙口市先科仪器公司；双列六孔电热恒温水浴锅，龙口市先科仪器公司；C30孔玻璃仪器气流烘干器， 郑州长城科工贸有限公司；SHB-B88循环水式真空泵，郑州长城科工贸有限公司。
1.2试验方法
1.2.1松针样品的前处理由于叶绿素等油溶性杂质易溶于石油醚[5]，而黄酮不溶于石油醚[6]，因此本试验采用石油醚浸提法对松针样品进行前处理，以除去叶绿素等油溶性杂质。
1.2.2提取工艺最优参数的确定以总黄酮提取率为评价指标，采用单因素试验，依次对乙醇浓度、提取温度、提取时间、料液比进行试验，以确定各因素最优值。在此基础上，采用四因素三水平正交试验进行进一步的工艺优化。
1.2.3总黄酮提取率的测定①标准曲线制作：天然产物中总黄酮含量的测定通常是以芦丁为标准品通过紫外可见分光光度法进行的[7]。本试验以芦丁为标准品，绘制标准曲线。方法为：准确移取0.00、0.50、1.00、1.50、2.00、2.50、3.00、3.50、4.00、5.00 mL芦丁标准品溶液于25 mL容量瓶，加入70%乙醇10.00 mL稀释，准确移入0.1 mol/L AlCl3 溶液2.00 mL、1.00 mol/L NaAc溶液3.00 mL，用70%乙醇定容至刻度摇匀，显色25 min，于282 nm波长下测定其吸光度，以标准品浓度（C）对吸光度（A）进行线性回归，所得标准曲线方程为：A=0.0068+28.66724×C，R=0.9998，线性关系良好（见图1）。
②松针样品总黄酮的测定：准确称取1 g松针待测样于250 mL烧瓶中，回流提取，冷却30 min，过滤，滤液定容至100 mL容量瓶。按照上述方法测定吸光度，根据公式求得总黄酮提取率。
2结果与分析
2.1松针样品前处理效果
由图2可以看出，经石油醚浸提后的吸收曲线（B）更加平缓，杂质峰明显减少，低波长处吸收峰的覆盖率降低，282 nm处出现了新的吸收峰，
峰型平缓，表明石油醚浸提除杂效果显著。
2.2单因素试验结果与分析
2.2.1乙醇浓度对总黄酮提取率的影响控制体系温度为75℃、料液比为1∶35、提取时间为3 h，设置不同的乙醇浓度对雪松松针中总黄酮进行提取，结果（图3）显示，随着乙醇浓度的增大，提取率先升高后降低，乙醇浓度为50%时提取率最高。因此，选取乙醇浓度40%、50%、60%三水平进行正交试验。
2.2.2浸提温度对总黄酮提取率的影响控制料液比为1∶35、提取时间3 h、乙醇浓度70%，设置不同的体系温度回流提取雪松松针中的总黄酮，结果（图4）表明，随着温度的升高，提取率逐渐升高至85℃时提取率最高，后略有降低。天然产物的提取过程中，温度对提取效果的影响较为复杂。松针中含有较多种类的活性物质，在不同温度下，会发生一些化学反应而降低黄酮含量[8]。较高的温度不但容易导致部分黄酮的分解[9]，而且不符合低能耗的原则，因此，选择 65、75、85℃为正交试验提取温度的三个水平。
2.2.3料液比对总黄酮提取率的影响控制体系温度为75℃、提取时间为3 h、乙醇浓度为70%，设置不同的料液比回流提取雪松松针中的总黄酮，结果（图5）表明，料液比为1∶45时总黄酮提取率最高。因此，选取1∶25、1∶35、1∶45为正交试验料液比的三个水平。
2.2.4提取时间对提取率的影响控制体系温度为75℃、乙醇浓度为70%、料液比为1∶35，改变松针中总黄酮的浸提时间，结果（图6）表明，回流提取时间为3 h时，黄酮提取率最高。因此，选取2、3、4 h为正交试验提取时间的三个水平。
2.3正交试验结果与分析
在单因素试验的基础上，进行四因素三水平正交试验，研究浸提温度、提取时间、料液比和乙醇浓度对雪松松针中总黄酮提取率的影响，结果（表1）显示，各因素对总黄酮提取率的影响顺序是：浸提温度>料液比>乙醇浓度>提取时间；各因素最优组合为：浸提温度75℃，料液比1∶45，乙醇浓度50%，提取时间3～4 h。因提取时间对总黄酮提取率的影响最小，且提取时间过长不仅会影响黄酮的稳定性，还会降低其提取效率，为节能降耗、提高效率，最终确定提取时间为2 h。
综上所述，雪松松针中总黄酮提取的最佳工艺条件为：浸提温度75℃，料液比1∶45，乙醇浓度50%，提取时间2 h。 2.4验证试验
准确称取1 g松针待测样，置于250 mL烧瓶中，加入50%的乙醇45 mL，于75℃恒温水浴回流提取2 h，冷却30 min后过滤至100 mL容量瓶中，定容，得待测液。取2.00 mL待测液于25 mL容量瓶中，加入70 %的乙醇10.00 mL稀释，准确移入0.1 mol/L AlCl3 溶液2.00 mL、1.00 mol/L NaAc溶液3.00 mL，用70%乙醇定容至刻度，摇匀，显色25 min，于282 nm波长下测定吸光度，计算总黄酮提取率。结果（表2） 表明，平均提取率为3.64%。虽与提取3～4 h相比，總黄酮提取率有所降低，但缩短了提取时间，提高了提取效率，降低了能耗，优化后的工艺条件有效可行。
3小结
本试验采用紫外分光光度法，以芦丁为标准品，以乙醇水溶液为提取剂，采用溶剂回流浸提法提取雪松松针中的总黄酮，并通过AlCl3-NaAc显色体系，在282 nm波长下测定总黄酮提取率。通过单因素试验和正交试验，确定了最佳提取工艺为：1 g雪松松针待测样，按照1∶45的料液比，加入50%乙醇为提取剂，保持温度为75℃回流提取2 h，所得总黄酮提取率为3.64%，RSD 4.04%。该提取工艺方法简单可行，效果稳定可靠。
参考文献：
[1]Liu D Y， Shi X F，Wang D D，et al. A new flavonoid in pine needles of Cedrus deodara[J]. Chinese Herbal Medicines， 2011， 3 （1）： 5-6.
[2]张志琴， 肖培云， 刘光明. 松针的化学成分和药理活性研究进展[J]. 现代药物与临床， 2011 （4）： 278-281.
[3]Vankar P S， Srivastava J. Comparative study of total phenol， flavonoid contents and antioxidant activity in Canna indica and Hibiscus rosa-sinensis： prospective natural food dyes[J]. International Journal of Food Engineering， 2008， 4 （3），DOI：10.2202/1556-3758.1232.
[4]刘东彦， 石晓峰， 李冲， 等. 雪松松针黄酮类化学成分的研究[J]. 中草药， 2011， 42（4）：631-633.
[5]马骏， 王超， 李秀妹， 等. 绿色植物色素的提取和色谱分离[J]. 化工时刊， 2009， 23（10）： 46-49.
[6]陈晓青，蒋新宇，刘佳佳. 中草药成分分离分析技术与方法[M]. 北京：化学工业出版社，2006.
[7]付煜荣， 姚荣章. 景天三七中总黄酮提取条件和含量分析[J]. 河北北方学院学报：医学版， 2010（1）：13-15.
[8]徐春生. 天然松针提取物在牙膏中的应用[J]. 牙膏工业， 2006（2）：23-25.
[9]李倩，钟玲，池汝安，等. 离子液体微波辅助提取葛根总黄酮[J]. 武汉工程大学学报， 2011， 33 （11）：31-34.