【摘 要】
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目的 对HIV-1整合酶蛋白进行原核表达、纯化以及复性研究.方法 从HIV-1 HXB2中PCR扩增出全长的整合酶基因,连入原核表达载体pET-30a中,得到pET-30a整合酶表达质粒.再将质粒转
【机 构】
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中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所传染病预防控制国家重点实验室
【基金项目】
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国家重点基础研究发展计划(973计划);
论文部分内容阅读
目的 对HIV-1整合酶蛋白进行原核表达、纯化以及复性研究.方法 从HIV-1 HXB2中PCR扩增出全长的整合酶基因,连入原核表达载体pET-30a中,得到pET-30a整合酶表达质粒.再将质粒转人大肠杆菌BL21中诱导表达,经镍柱纯化后得到整合酶蛋白.纯化后蛋白在FoldIt复性液中进行稀释复性确定最佳复性液,然后蛋白在此条件下复性并用反相柱回收,最后通过对复性蛋白抽干及再溶分析复性蛋白的物理稳定性.结果 HIV-1整合酶蛋白主要以包涵体形式表达,表达量占菌体总量的10%.经镍柱纯化后蛋白的总浓度为0.9 mg/ml.蛋白的最佳复性液是:Tris-Cl 55 mmol/L,NaCl 264 mmol/L,KCl 11 mmol/L,Gu-HCl 550 mmol/L,EDTA 1.1 mmol/L,以及附加成分中的GSH、GSSG.复性后蛋白抽干后再溶,溶液清亮透明,SDS-PAGE可见有寡聚体状态的蛋白.结论 成功构建了pET-30a整合酶表达质粒.纯化后蛋白的浓度较高.确定了最佳的蛋白复性液.并且初步检测了复性蛋白的物理稳定性.这为蛋白体外活性研究和AIDS药物研究打下了基础.
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