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摘要：目的 观察桦木酸（betulinic acid，BA）对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖的影响，并从细胞生长周期和细胞凋亡两方面初步探讨其抗肝癌的作用机制。方法 体外培养人肝癌HepG2肿瘤干细胞并证明其自我更新能力。CCK-8法检测40、20、10、5、2.5、1.25 μmol/L BA作用人肝癌HepG2肿瘤干细胞24、48 h的细胞活力；40、20、10、5 μmol/L BA作用人肝癌HepG2肿瘤干细胞48 h，流式细胞术检测细胞周期和细胞凋亡率。结果 BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖有明显的抑制作用，并呈一定的量-效关系；BA能明显影响肿瘤干细胞周期，诱导肿瘤干细胞凋亡，40 μmol/L BA明显阻滞细胞周期于S期，且细胞凋亡率达到10.86%。结论 BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖具有明显的抑制作用，其可能通过影响肿瘤干细胞周期及诱导肿瘤干细胞凋亡而发挥作用。
关键词：桦木酸；石见穿；人肝癌HepG2细胞；肿瘤干细胞；细胞凋亡
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.016
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）02-0060-05
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是紧随肺癌、胃癌、食管癌之后的发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。最新数据显示，肝癌在60岁以下的男性中属发病率最高和死亡率最高的癌症[1]。由于肝癌的高复发、高转移率和化疗抗药性，治疗效果并不乐观。近年来，越来越多的学者认为彻底治愈肿瘤的有效疗
法除针对肿瘤组织中的大部分肿瘤细胞，更重要的是靶向其中的肿瘤干细胞[2-3]。肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）是肿瘤组织中存在的极小部分细胞，通常处于静止状态，当受到细胞因子等影响时会导致肿瘤的发生、转移和复发，这均源于CSC拥有很强的自我更新及增殖分化的能力。我们前期以S180荷瘤小鼠、H22荷瘤小鼠为模型进行体内筛选，发现中药石见穿具有较好的抗肿瘤作用[4-5]，进一步对石见穿进行化学成分分析，发现桦木酸（betulinic acid，BA）为石见穿发挥抗肿瘤作用的主要有效成分之一。因此，本实验观察BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖的影响，并从细胞生长周期和细胞凋亡两方面初步探讨其抗肝癌的作用机制。
1 实验材料
1.1 细胞株
人肝癌HepG2细胞株，中国科学院细胞库，目录号TCHu72。
1.2 主要试剂与仪器
BA（Sigma），5-氟尿嘧啶（5-FU，海普药业），胎牛血清（Gibco），DMEM/F12+GlutaMAX-I培養基（Gibco），肝素（Sigma），B27神经细胞生长添加剂（Gibco），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，Acro Biosystem），成纤维细胞生长因子（EGF，Acro Biosystem），BSA（Sigma），青链霉素混合液（Solarbio），磷酸盐缓冲液（HyClone），0.25%胰蛋白酶、DMSO（MP Biomedicals），无酚红DMEM（Macgene），CCK-8试剂盒（Dojindo），细胞周期试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），FITC Annexin V凋亡试剂盒（BD）。MCO175型CO2培养箱（德国Galaxy公司），TH-200型显微镜（日本Olympus公司），Stnergy-4型酶标仪（美国Biotek公司），IEC-CL31R型离心机（美国Thermo Fisher公司），NAVISO型流式细胞仪（美国Bechman Coulter公司），JCSO344型高压蒸汽灭菌锅（日本Hirayama公司）。
2 实验方法
2.1 人肝癌HepG2肿瘤干细胞培养
参考文献[6-7]进行无血清培养基的制备及人肝癌HepG2肿瘤球干细胞的培养和传代。
2.1.1 无血清干细胞培养基制备 在DMEM/F12培养基中添加20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、2% B27、4 μg/mL肝素、0.4%BSA、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。
2.1.2 细胞培养 正常培养人肝癌HepG2细胞，胰酶消化无血清培养基重悬，计数，稀释为2×103/mL，2.5 mL/孔，则5×103/孔接种于低吸附6孔板。置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。1 d后可观察到有悬浮细胞球形成。每3 d半量换液。
2.1.3 细胞传代 当细胞形成悬浮细胞球（约6 d），进行传代培养。将含细胞培养液悬浮细胞收集于离心管中，800 r/min离心5 min，1 mL胰酶替代物TrypLE Express消化，加胰酶时吹打几下稍等片刻，即可加PBS稀释，离心洗涤2～3次后无血清培养基重悬，再取适量加无血清培养基稀释培养。
2.2 分组和给药
正常组：DMEM培养基；对照组：DMEM培养基（含0.01%DMSO）；5-FU组：10 μg/mL 5-FU；BA各剂量组：DMSO为溶剂制备40 mmol/L BA，实验过程中以1000倍培养液稀释为40 μmol/L，同时等比对倍稀释分别得到浓度为20、10、5、2.5、1.25 μmol/L的BA培养液。
2.3 细胞自我更新能力验证
收集肿瘤干细胞，无血清培养基稀释为每毫升500个。在低吸附96孔板上每孔加入150 μL无血清培养基，并将稀释好的肿瘤干细胞2 μL/孔加入96孔板。镜下观察，选取有且仅有1个细胞的孔每日拍照记录。
2.4 细胞增殖检测
将对数生长期的人肝癌HepG2肿瘤干细胞制成1×108/L的细胞悬液，接种于低吸附96孔板，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，24 h后更换不含细胞因子的DMEM/F12培养基同步化使细胞处于G0期，24 h后分组处理，分别培养于BA浓度为40、20、10、5 μmol/L的无血清培养基中，每组设5个复孔，继续培养。48 h后弃上清液，PBS冲洗1遍后每孔加入配制好的CCK-8试剂120 μL，培养箱中继续孵育2 h。将显色完成的液体转移至正常96孔板中，于酶标仪波长490 nm处检测吸光度（OD）值。计算细胞抑制率。细胞抑制率（%）=（对照孔OD值-给药孔OD值）÷对照孔OD值×100%。 2.5 细胞周期检测
将人肝癌HepG2肿瘤干细胞用胰酶替代物消化，无血清培养液重悬，计数，稀释为5×103/mL，3 mL/孔接种于6孔板中。待细胞稳定成球，将各孔悬浮细胞培养液转移至离心管中，1500 r/min离心5～10 min，吸弃原培养液，PBS冲洗1遍，加入无血清培养基进行同步化。24 h后按上述方法离心，吸弃无血清培养基，按照分组给药。药物作用48 h后，将各组细胞培养液收集到离心管中。1000×g离心3～5 min，沉淀细胞。吸除上清，加入约1 mL冰浴预冷的PBS重悬细胞，并转移至1.5 mL离心管中。再次离心沉淀细胞，弃上清，加入1 mL冰浴预冷的70%乙醇，轻轻吹打均匀，4 ℃固定，过夜。离心，沉淀细胞，弃上清液，用1 mL冰浴PBS冲洗1遍。每管细胞样品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞，37 ℃避光温浴30 min，24 h内流式细胞仪检测。
2.6 细胞凋亡检测
将人肝癌HepG2肿瘤干细胞用胰酶替代物消化，无血清培养液重悬，计数，稀释为5×103/mL，3 mL/孔接种于6孔板中。待细胞稳定成球，将各孔悬浮细胞培养液转移至离心管中，1500 r/min离心5～10 min，吸弃原培养液，PBS冲洗1遍，加入无血清培养基进行同步化。24 h后按上述方法离心，吸弃无血清培养基，按照分组给药。药物作用48 h后，将各组细胞培养液收集到离心管中，1500 r/min离心5～10 min，吸弃上清液，加入1 mL冰浴预冷的PBS冲洗细胞2次。用1×Binding Buffer缓冲液制成1×106/mL的悬液，吸取上述悬液100 μL至Falcon试管，加入FITC Annexin V和碘化丙啶染料，轻轻涡旋，室温避光放置15 min后，分别加入1×Binding Buffer缓冲液400 μL，1 h内流式细胞仪检测，严格按照凋亡试剂盒说明书进行操作。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，各组数据通过正态性分布检验和方差齐性检验后，组间比较采用方差分析或者非参数检验法。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 人肝癌HepG2肿瘤干细胞自我更新能力
选取有且仅有1个细胞的孔连续观察，第6日可看到细胞增殖，第8日细胞增殖数目明显增多。结果见图1。
5 讨论
BA是一种五环三萜类化合物，最早发现于桦木属植物白桦的树皮中。研究发现，BA具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等多种药理活性[8]，其中抗肿瘤是该化学成分的主要药理作用。20世纪90年代，科学家对2500种植物提取物进行抗癌活性实验，发现BA对人黑色素瘤具有选择性的抗癌活性[9]，随后在乳腺癌、脑癌、前列腺癌、结肠癌、白血病等常见肿瘤中均验证了BA的抗肿瘤作用[10]。与BA对多种肿瘤具有潜在毒性不同的是，非肿瘤细胞及正常组织对BA有相对抵抗性[11]。 目前关于BA的抗肿瘤作用及机制已进行了许多研究，但有关该化学成分对肝癌的作用研究至今还未见报道。因此，本实验观察对无血清培养的人肝癌HepG2肿瘤干细胞的自我更新能力进行了验证。其次，CCK-8实验结果显示，BA作用48 h后，对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖活力抑制作用增强，并呈明显的量-效关系。我们前期研究发现，BA对HepG2细胞的IC50为19.68 μmol/L，而该实验中BA作用于HepG2干细胞48 h的IC50为18.30 μmol/L，表明BA在抑制HepG2干細胞与HepG2细胞的增殖活力上效果相似。我们通过流式细胞仪进行细胞周期检测发现，高浓度BA（40 μmol/L）能抑制HepG2肿瘤干细胞从S期进入G2/M期，将其阻滞于S期，表明高浓度BA通过抑制DNA的合成抑制HepG2细胞的生长。而5-FU则是将HepG2干细胞周期阻滞于G0/G1期来抑制细胞增殖，表明BA与5-FU对HepG2干细胞具有不同的作用途径，其分子机制有待进一步研究。
细胞凋亡是正常的生理过程，此过程中，细胞膜保持完整，胞内物质不释放出胞外，不引发胞外组织的炎性反应[12]。有研究表明，BA通过诱导黑色素瘤细胞的凋亡发挥其抗肿瘤作用。蒋孟军等[13]认为，BA能够体外抑制胰腺癌细胞的生长并诱导细胞凋亡。Chakraborty B等[14]也发现，BA衍生物是人结肠癌细胞HT-29细胞凋亡的诱导剂。同时，本实验也发现，BA可明显诱导HepG2肿瘤干细胞凋亡，且具有明显的浓度依赖性。40 μmol/L BA作用于HepG2细胞后，其凋亡率可达10.86%，可见BA的抗肿瘤作用与诱导细胞凋亡有密切的关系。
细胞凋亡与细胞周期之间有许多潜在的关系，通常细胞先被阻滞于细胞的某一周期，然后诱导其发生凋亡，目前很多肿瘤化疗药物正是通过细胞周期阻滞来诱导细胞凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的。蒋孟军等[13]研究表明，BA将胰腺癌细胞阻滞于G0期来诱导其凋亡。Foo J B等[15]发现，BA作为黄花第伦桃二氯甲烷提取物的主要成分，通过p53/p21通路将乳腺癌MCF-7细胞阻滞于G0/G1期。但本实验发现，低浓度BA（5～20 μmol/L）几乎对细胞周期没有影响，而对HepG2细胞的凋亡率作用显著，可见BA对HepG2肿瘤干细胞的凋亡与周期阻断并无特定联系。高浓度处理的细胞被阻滞于S期，说明BA通过S期阻断而诱导细胞凋亡，这可能是BA诱导HepG2肿瘤干细胞凋亡作用途径的一部分，而低浓度BA诱导凋亡的作用方式并未通过细胞周期阻滞实现，这与高浓度BA诱导凋亡的途径不同。因此，BA诱导HepG2干细胞的细胞凋亡可能是多途径的复杂过程，BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞的增殖抑制作用仍有待于进一步研究。
参考文献：
[1] CHEN W， ZHENG R， BAADE P D， et al. Cancer statistics in China， 2015[J]. CA cancer J Clin，2016，66（2）：115-132. [2] VIRA D， BASAK S K， VEENA M S， et al. Cancer stem cells， microRNAs， and therapeutic strategies including natural products[J]. Cancer Metastasis Rev，2012，31（3/4）：733-751.
[3] YANG C， JIN K， TONG Y， et al. Therapeutic potential of cancer stem cells[J]. Med Oncol，2015，32（6）：619.
[4] 柳芳，刘建勋，李军梅，等.石见穿对肝癌H22荷瘤小鼠肿瘤生长的影响[J].中国实验方剂学杂志，2012，18（12）：249-251.
[5] 柳芳，刘建勋，任钧国，等.石见穿提取物通过阻断血管生成抑制肿瘤生长的研究[J].中国中药杂志，2012，37（9）：1285-1288.
[6] PENG Y C， LU S D， ZHONG J H， et al. Combination of 5-fluorouracil and 2-morphilino-8-phenyl-4H-chromen-4-one may inhibit liver cancer stem cell activity[J]. Tumour Biol，2016，37（8）：10943-10958.
[7] WANG L， HUANG X， ZHENG X， et al. Enrichment of prostate cancer stem cells from human prostate cancer cell lines by culture in serum-free medium and chemoradiotherapy[J]. Int J Bio Sci， 2013，9（5）：472-479.
[8] LEE S Y， KIM H H， PARK S U. Recent studies on betulinic acid and its biological and pharmacological activity[J]. EXCLI J， 2015，14：199-203.
[9] PISHA E， CHAI H， LEE I S， et al. Discovery of betulinic acid as a selective inhibitor of human melanoma that functions by induction of apoptosis[J]. Nat Med，1995，1（10）：1046-1051.
[10] FULDA S. Betulinic acid：a natural product with anticancer activity[J]. Mol Nutr Food Res，2009，53（1）：140-146.
[11] SEYED M A， JANTAN I， VIJAYARAGHAVAN K， et al. Betulinic acid：recent advances in chemical modifications， effective delivery， and molecular mechanisms of a promising anticancer therapy[J]. Chem Biol Drug Des，2016，87（4）：517-536.
[12] OUYANG L， SHI Z， ZHAO S， et al. Programmed cell death pathways in cancer：a review of apoptosis， autophagy and programmed necrosis[J]. Cell Prolif，2012，45（6）：487-498.
[13] 蔣孟军，周尧远，杨敏，等.白桦酸对人胰腺癌细胞增殖、迁移、细胞周期和凋亡的影响[J].中国中药杂志，2010，35（22）：3056-3059.
[14] CHAKRABORTY B， DUTTA D， MUKHERJEE S， et al. Synthesis and biological evaluation of a novel betulinic acid derivative as an inducer of apoptosis in human colon carcinoma cells （HT-29）[J]. Eur J Med Chem，2015，102：93-105.
[15] FOO J B， SAIFUL YAZAN L， TOR Y S， et al. Induction of cell cycle arrest and apoptosis by betulinic acid-rich fraction from Dillenia suffruticosa root in MCF-7 cells involved p53/p21 and mitochondrial signalling pathway[J]. J Ethnopharmacol，2015，166：270-278.
（收稿日期：2016-04-20）
（修回日期：2016-05-05；编辑：华强）
关键词：桦木酸；石见穿；人肝癌HepG2细胞；肿瘤干细胞；细胞凋亡
DOI：10.3969/j.issn.1005-5304.2017.02.016
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2017）02-0060-05
肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是紧随肺癌、胃癌、食管癌之后的发病率和死亡率较高的恶性肿瘤。最新数据显示，肝癌在60岁以下的男性中属发病率最高和死亡率最高的癌症[1]。由于肝癌的高复发、高转移率和化疗抗药性，治疗效果并不乐观。近年来，越来越多的学者认为彻底治愈肿瘤的有效疗
法除针对肿瘤组织中的大部分肿瘤细胞，更重要的是靶向其中的肿瘤干细胞[2-3]。肿瘤干细胞（cancer stem cell，CSC）是肿瘤组织中存在的极小部分细胞，通常处于静止状态，当受到细胞因子等影响时会导致肿瘤的发生、转移和复发，这均源于CSC拥有很强的自我更新及增殖分化的能力。我们前期以S180荷瘤小鼠、H22荷瘤小鼠为模型进行体内筛选，发现中药石见穿具有较好的抗肿瘤作用[4-5]，进一步对石见穿进行化学成分分析，发现桦木酸（betulinic acid，BA）为石见穿发挥抗肿瘤作用的主要有效成分之一。因此，本实验观察BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖的影响，并从细胞生长周期和细胞凋亡两方面初步探讨其抗肝癌的作用机制。
1 实验材料
1.1 细胞株
人肝癌HepG2细胞株，中国科学院细胞库，目录号TCHu72。
1.2 主要试剂与仪器
BA（Sigma），5-氟尿嘧啶（5-FU，海普药业），胎牛血清（Gibco），DMEM/F12+GlutaMAX-I培養基（Gibco），肝素（Sigma），B27神经细胞生长添加剂（Gibco），碱性成纤维细胞生长因子（bFGF，Acro Biosystem），成纤维细胞生长因子（EGF，Acro Biosystem），BSA（Sigma），青链霉素混合液（Solarbio），磷酸盐缓冲液（HyClone），0.25%胰蛋白酶、DMSO（MP Biomedicals），无酚红DMEM（Macgene），CCK-8试剂盒（Dojindo），细胞周期试剂盒（上海碧云天生物技术有限公司），FITC Annexin V凋亡试剂盒（BD）。MCO175型CO2培养箱（德国Galaxy公司），TH-200型显微镜（日本Olympus公司），Stnergy-4型酶标仪（美国Biotek公司），IEC-CL31R型离心机（美国Thermo Fisher公司），NAVISO型流式细胞仪（美国Bechman Coulter公司），JCSO344型高压蒸汽灭菌锅（日本Hirayama公司）。
2 实验方法
2.1 人肝癌HepG2肿瘤干细胞培养
参考文献[6-7]进行无血清培养基的制备及人肝癌HepG2肿瘤球干细胞的培养和传代。
2.1.1 无血清干细胞培养基制备 在DMEM/F12培养基中添加20 ng/mL EGF、10 ng/mL bFGF、2% B27、4 μg/mL肝素、0.4%BSA、100 U/mL青霉素和100 μg/mL链霉素。
2.1.2 细胞培养 正常培养人肝癌HepG2细胞，胰酶消化无血清培养基重悬，计数，稀释为2×103/mL，2.5 mL/孔，则5×103/孔接种于低吸附6孔板。置于37 ℃、5%CO2培养箱中培养。1 d后可观察到有悬浮细胞球形成。每3 d半量换液。
2.1.3 细胞传代 当细胞形成悬浮细胞球（约6 d），进行传代培养。将含细胞培养液悬浮细胞收集于离心管中，800 r/min离心5 min，1 mL胰酶替代物TrypLE Express消化，加胰酶时吹打几下稍等片刻，即可加PBS稀释，离心洗涤2～3次后无血清培养基重悬，再取适量加无血清培养基稀释培养。
2.2 分组和给药
正常组：DMEM培养基；对照组：DMEM培养基（含0.01%DMSO）；5-FU组：10 μg/mL 5-FU；BA各剂量组：DMSO为溶剂制备40 mmol/L BA，实验过程中以1000倍培养液稀释为40 μmol/L，同时等比对倍稀释分别得到浓度为20、10、5、2.5、1.25 μmol/L的BA培养液。
2.3 细胞自我更新能力验证
收集肿瘤干细胞，无血清培养基稀释为每毫升500个。在低吸附96孔板上每孔加入150 μL无血清培养基，并将稀释好的肿瘤干细胞2 μL/孔加入96孔板。镜下观察，选取有且仅有1个细胞的孔每日拍照记录。
2.4 细胞增殖检测
将对数生长期的人肝癌HepG2肿瘤干细胞制成1×108/L的细胞悬液，接种于低吸附96孔板，于37 ℃、5%CO2培养箱中培养，24 h后更换不含细胞因子的DMEM/F12培养基同步化使细胞处于G0期，24 h后分组处理，分别培养于BA浓度为40、20、10、5 μmol/L的无血清培养基中，每组设5个复孔，继续培养。48 h后弃上清液，PBS冲洗1遍后每孔加入配制好的CCK-8试剂120 μL，培养箱中继续孵育2 h。将显色完成的液体转移至正常96孔板中，于酶标仪波长490 nm处检测吸光度（OD）值。计算细胞抑制率。细胞抑制率（%）=（对照孔OD值-给药孔OD值）÷对照孔OD值×100%。 2.5 细胞周期检测
将人肝癌HepG2肿瘤干细胞用胰酶替代物消化，无血清培养液重悬，计数，稀释为5×103/mL，3 mL/孔接种于6孔板中。待细胞稳定成球，将各孔悬浮细胞培养液转移至离心管中，1500 r/min离心5～10 min，吸弃原培养液，PBS冲洗1遍，加入无血清培养基进行同步化。24 h后按上述方法离心，吸弃无血清培养基，按照分组给药。药物作用48 h后，将各组细胞培养液收集到离心管中。1000×g离心3～5 min，沉淀细胞。吸除上清，加入约1 mL冰浴预冷的PBS重悬细胞，并转移至1.5 mL离心管中。再次离心沉淀细胞，弃上清，加入1 mL冰浴预冷的70%乙醇，轻轻吹打均匀，4 ℃固定，过夜。离心，沉淀细胞，弃上清液，用1 mL冰浴PBS冲洗1遍。每管细胞样品中加入0.5 mL碘化丙啶染色液，缓慢并充分重悬细胞，37 ℃避光温浴30 min，24 h内流式细胞仪检测。
2.6 细胞凋亡检测
将人肝癌HepG2肿瘤干细胞用胰酶替代物消化，无血清培养液重悬，计数，稀释为5×103/mL，3 mL/孔接种于6孔板中。待细胞稳定成球，将各孔悬浮细胞培养液转移至离心管中，1500 r/min离心5～10 min，吸弃原培养液，PBS冲洗1遍，加入无血清培养基进行同步化。24 h后按上述方法离心，吸弃无血清培养基，按照分组给药。药物作用48 h后，将各组细胞培养液收集到离心管中，1500 r/min离心5～10 min，吸弃上清液，加入1 mL冰浴预冷的PBS冲洗细胞2次。用1×Binding Buffer缓冲液制成1×106/mL的悬液，吸取上述悬液100 μL至Falcon试管，加入FITC Annexin V和碘化丙啶染料，轻轻涡旋，室温避光放置15 min后，分别加入1×Binding Buffer缓冲液400 μL，1 h内流式细胞仪检测，严格按照凋亡试剂盒说明书进行操作。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。计量资料以—x±s表示，各组数据通过正态性分布检验和方差齐性检验后，组间比较采用方差分析或者非参数检验法。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 人肝癌HepG2肿瘤干细胞自我更新能力
选取有且仅有1个细胞的孔连续观察，第6日可看到细胞增殖，第8日细胞增殖数目明显增多。结果见图1。
5 讨论
BA是一种五环三萜类化合物，最早发现于桦木属植物白桦的树皮中。研究发现，BA具有抗肿瘤、抗炎、抗病毒等多种药理活性[8]，其中抗肿瘤是该化学成分的主要药理作用。20世纪90年代，科学家对2500种植物提取物进行抗癌活性实验，发现BA对人黑色素瘤具有选择性的抗癌活性[9]，随后在乳腺癌、脑癌、前列腺癌、结肠癌、白血病等常见肿瘤中均验证了BA的抗肿瘤作用[10]。与BA对多种肿瘤具有潜在毒性不同的是，非肿瘤细胞及正常组织对BA有相对抵抗性[11]。 目前关于BA的抗肿瘤作用及机制已进行了许多研究，但有关该化学成分对肝癌的作用研究至今还未见报道。因此，本实验观察对无血清培养的人肝癌HepG2肿瘤干细胞的自我更新能力进行了验证。其次，CCK-8实验结果显示，BA作用48 h后，对人肝癌HepG2肿瘤干细胞增殖活力抑制作用增强，并呈明显的量-效关系。我们前期研究发现，BA对HepG2细胞的IC50为19.68 μmol/L，而该实验中BA作用于HepG2干细胞48 h的IC50为18.30 μmol/L，表明BA在抑制HepG2干細胞与HepG2细胞的增殖活力上效果相似。我们通过流式细胞仪进行细胞周期检测发现，高浓度BA（40 μmol/L）能抑制HepG2肿瘤干细胞从S期进入G2/M期，将其阻滞于S期，表明高浓度BA通过抑制DNA的合成抑制HepG2细胞的生长。而5-FU则是将HepG2干细胞周期阻滞于G0/G1期来抑制细胞增殖，表明BA与5-FU对HepG2干细胞具有不同的作用途径，其分子机制有待进一步研究。
细胞凋亡是正常的生理过程，此过程中，细胞膜保持完整，胞内物质不释放出胞外，不引发胞外组织的炎性反应[12]。有研究表明，BA通过诱导黑色素瘤细胞的凋亡发挥其抗肿瘤作用。蒋孟军等[13]认为，BA能够体外抑制胰腺癌细胞的生长并诱导细胞凋亡。Chakraborty B等[14]也发现，BA衍生物是人结肠癌细胞HT-29细胞凋亡的诱导剂。同时，本实验也发现，BA可明显诱导HepG2肿瘤干细胞凋亡，且具有明显的浓度依赖性。40 μmol/L BA作用于HepG2细胞后，其凋亡率可达10.86%，可见BA的抗肿瘤作用与诱导细胞凋亡有密切的关系。
细胞凋亡与细胞周期之间有许多潜在的关系，通常细胞先被阻滞于细胞的某一周期，然后诱导其发生凋亡，目前很多肿瘤化疗药物正是通过细胞周期阻滞来诱导细胞凋亡，从而达到治疗肿瘤的目的。蒋孟军等[13]研究表明，BA将胰腺癌细胞阻滞于G0期来诱导其凋亡。Foo J B等[15]发现，BA作为黄花第伦桃二氯甲烷提取物的主要成分，通过p53/p21通路将乳腺癌MCF-7细胞阻滞于G0/G1期。但本实验发现，低浓度BA（5～20 μmol/L）几乎对细胞周期没有影响，而对HepG2细胞的凋亡率作用显著，可见BA对HepG2肿瘤干细胞的凋亡与周期阻断并无特定联系。高浓度处理的细胞被阻滞于S期，说明BA通过S期阻断而诱导细胞凋亡，这可能是BA诱导HepG2肿瘤干细胞凋亡作用途径的一部分，而低浓度BA诱导凋亡的作用方式并未通过细胞周期阻滞实现，这与高浓度BA诱导凋亡的途径不同。因此，BA诱导HepG2干细胞的细胞凋亡可能是多途径的复杂过程，BA对人肝癌HepG2肿瘤干细胞的增殖抑制作用仍有待于进一步研究。
参考文献：
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（收稿日期：2016-04-20）
（修回日期：2016-05-05；编辑：华强）