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摘要[目的]研究高山离子芥CbCBF1基因的耐盐性功能。[方法]将高山离子芥的愈伤组织在高盐条件下进行时间梯度处理后，采用Real time PCR和Western blot分析CbCBF1在盐胁迫下转录和翻译水平表达量的变化。[结果]CbCBF1响应高盐胁迫，并随着处理时间的不同表达量呈现不同的变化趋势。[结论]该方法考察了高山离子芥CbCBF1基因的耐盐性功能，为高山离子芥CbCBF1基因的的进一步开发利用提供了依据。
关键词CbCBF1；盐胁迫；表达
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04175-01
The Preliminary Functional Research on the Salt Tolerance of CbCBF1
HE Jiongjie（Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of CAAS， Lanhzou， Gansu 730050）
Abstract[Objective] To study salt tolerance function of CbCBF1. [Method] Time gradient processing was taken on the callus of CbCBF1 in extreme condition of high salt. Then the change of transcription expression of CbCBF1 was analyzed under the salt stress by Real time PCR and Western blot. [Result] It was found that CbCBF1 response to salt stress， and the express of CbCBF1 present different trends under the different processing time. [Conclusion] The salt tolerance function of CbCBF1 was investigated， which will provide reference for further development and utilization of CbCBF1.
Key words CbCBF1； High salt stress； Expression
低溫诱导能够产生转录因子CBF，CBF属于DNA结合蛋白AP2/ERF家族，该家族成员均含有AP2 DNA结合域[1]。CBF诱导蛋白可以和下游COR基因启动子中的CRT BOX相结合，诱导COR基因的表达，同时也能诱导一些生物合成酶基因的表达[2-4]。目前国内外研究发现，CBF调控的基因参与多种生理生化反应，如磷酸肌醇代谢和转录、活性氧清除物转运、激素代谢和信号转导，这些活动普遍发生在植物抗逆应答的过程中[5-6]。
高山离子芥是一种生活在天山冰川附近的植物，其生活环境海拔较高，气候干燥、寒冷，具有较强的紫外线照射。虽然高山离子芥具有发达的通气组织和厚壁组织，但其依然不具备典型的抗逆特征。因此其能够在这一环境极端恶劣地区较好的生长和发育，一定与其体内特殊的分子信号传导机制密不可分[7]。笔者对高山离子芥CbCBF1进行研究，以期在非模式植物中对CBF1转录因子进行深层次的认识，为后续研究该基因所介导的信号通路，利用基因工程技术综合改良作物和园艺植物的抗逆性提供一种全新而有效的技术途径。
1 材料与方法
1.1材料 载体和RNA提取试剂盒，由Tiangen公司生产；CbCBF1的cDNA全长序列，由实验室通过抑制性消减杂交和RACE技术获得；CbCBF1纯化蛋白和兔抗，由实验室提供。
1.2方法
浮组织总蛋白并测定总蛋白浓度。以离子芥悬浮组织的总蛋白作为内参。将不同时间梯度下的总蛋白依照一定上样量做SDS-PAGE胶检测；并借助生物学分析软件image J对调整好的内参做灰度分析，求得相应灰度值。借助Western-blot技术分别研究不同处理组中离子悬浮组织CbCBF1蛋白的表达。曝光显影后做灰度分析，得到CbCBF1蛋白表达水平的相关数据。
2结果与分析
2.1盐处理对CbCBF1转录水平的调节性 实时荧光定量PCR的结果表明，盐处理对于CbCBF1基因相对mRNA含量影响较大，1～6 h CbCBF1基因的相对mRNA含量处于不断上升和降低的震荡期，在盐处理12 h以后CbCBF1基因的相对mRNA含量具有明显的上调，在盐处理48 h时，CbCBF1基因的相对mRNA含量上调倍数达到10倍以上，72 h却有出现明显的下降，说明离子芥CbCBF1基因对盐胁迫较为敏感（图1）。
图1盐胁迫处理下，离子芥CbCBF1基因相对mRNA含量的变化2.2盐处理对CbCBF1翻译水平的调节性 Western-blot技术结果显示，CbCBF1蛋白的表达量在1～12 h均呈现出下降趋势，但整体维持在一个相对稳定的水平下，24 h开始上升，在48 h时时表达量则上调至最高点，72 h稍有回落，但仍然维持在一个较高的水平，说明CbCBF1在（图2）。
3结论与讨论
试验发现经过盐处理后，CbCBF1基因在转录和翻译水平的表达量均具有显著的变化，说明CbCBF1参与高山离子芥耐盐相关信号通路，响应盐胁迫。盐处理下，CbCBF1基因在前48 h内转录和翻译水平上的表达趋势相似，表明CbCBF1基因在响应盐胁迫的信号通路中可能作为次级信号。高山离子芥悬浮组织在150 mmol/L NaCl盐环境下随着时间会逐渐发白，盐处理72 h时提取的总蛋白浓度极低；而 圖2盐胁迫处理下离子芥CbCBF1蛋白表达量变化趋势及灰度分析图CbCBF1蛋白的表达量却依然在很高的水平。这说明CbCBF1基因可能参与细胞凋亡及组织坏死的信号调节网络[8]。
安徽农业科学2014年参考文献
[1] BADAWI M，DANYLUK J，BOUCHO B，et al.The CBF gene family in hexaploid wheat and its relationship to the phylogenetic complexity of cereal CBFs[J].Mol Genet Genomics，2007，277：533-554.
[2] GILMOUR S J，FOWLER S G，THOMASHOW M F.Arabidopsis transcriptional activators CBF1，CBF2，and CBF3 have matching functional activities[J].Plant Mol Biol，2004，54：767-781.
[3] GILMOUR S J，SEBOLT A M，SALAZARM P.Overexpression of the Arabidopsis CBF3 transcript ional activator mimics multiple biochemical changes associated with cold acclimation[J].Plant Physiol1，2000，24（4）：1854-1865.
[4] STEPONKUS P L.A contrast of the cryostability of the plasma membrane of winter rye and spring oat[M].London：JAI Press，1993：211-312.
[5] STOCKINGER E J，MAO Y，REGIER M K.Transcriptor adaptor and histone acetyltransferase proteins in Arabidopsis and their interactions with CBF1，a transcriptional activator involved in cold-regulated gene expression[J].Nucleic Acid Res，2000，29：1524-1533.
[6] STOCKINGER E J，GILMOURS S J，THOMASHOW M F.Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the Crepeat/DRE， a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94：1035-1040.
[7] VOGEL J T，ZARKA D G，VAN BUSKIRK H A，et al.Roles of the CBF2 and ZAT12 transcription factors in configuring the low temperature transcriptome of Arabidopsis[J].Plant J，2005，41：195-211.
[8] GILMOUR S J，ZARKA D G，STOCKINGER E J，et al.Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold induced COR gene expression[J].Plant J，1998，16：433-442.
关键词CbCBF1；盐胁迫；表达
中图分类号S188文献标识码A文章编号0517-6611（2014）14-04175-01
The Preliminary Functional Research on the Salt Tolerance of CbCBF1
HE Jiongjie（Lanzhou Institute of Husbandry and Pharmaceutical Science of CAAS， Lanhzou， Gansu 730050）
Abstract[Objective] To study salt tolerance function of CbCBF1. [Method] Time gradient processing was taken on the callus of CbCBF1 in extreme condition of high salt. Then the change of transcription expression of CbCBF1 was analyzed under the salt stress by Real time PCR and Western blot. [Result] It was found that CbCBF1 response to salt stress， and the express of CbCBF1 present different trends under the different processing time. [Conclusion] The salt tolerance function of CbCBF1 was investigated， which will provide reference for further development and utilization of CbCBF1.
Key words CbCBF1； High salt stress； Expression
低溫诱导能够产生转录因子CBF，CBF属于DNA结合蛋白AP2/ERF家族，该家族成员均含有AP2 DNA结合域[1]。CBF诱导蛋白可以和下游COR基因启动子中的CRT BOX相结合，诱导COR基因的表达，同时也能诱导一些生物合成酶基因的表达[2-4]。目前国内外研究发现，CBF调控的基因参与多种生理生化反应，如磷酸肌醇代谢和转录、活性氧清除物转运、激素代谢和信号转导，这些活动普遍发生在植物抗逆应答的过程中[5-6]。
高山离子芥是一种生活在天山冰川附近的植物，其生活环境海拔较高，气候干燥、寒冷，具有较强的紫外线照射。虽然高山离子芥具有发达的通气组织和厚壁组织，但其依然不具备典型的抗逆特征。因此其能够在这一环境极端恶劣地区较好的生长和发育，一定与其体内特殊的分子信号传导机制密不可分[7]。笔者对高山离子芥CbCBF1进行研究，以期在非模式植物中对CBF1转录因子进行深层次的认识，为后续研究该基因所介导的信号通路，利用基因工程技术综合改良作物和园艺植物的抗逆性提供一种全新而有效的技术途径。
1 材料与方法
1.1材料 载体和RNA提取试剂盒，由Tiangen公司生产；CbCBF1的cDNA全长序列，由实验室通过抑制性消减杂交和RACE技术获得；CbCBF1纯化蛋白和兔抗，由实验室提供。
1.2方法
浮组织总蛋白并测定总蛋白浓度。以离子芥悬浮组织的总蛋白作为内参。将不同时间梯度下的总蛋白依照一定上样量做SDS-PAGE胶检测；并借助生物学分析软件image J对调整好的内参做灰度分析，求得相应灰度值。借助Western-blot技术分别研究不同处理组中离子悬浮组织CbCBF1蛋白的表达。曝光显影后做灰度分析，得到CbCBF1蛋白表达水平的相关数据。
2结果与分析
2.1盐处理对CbCBF1转录水平的调节性 实时荧光定量PCR的结果表明，盐处理对于CbCBF1基因相对mRNA含量影响较大，1～6 h CbCBF1基因的相对mRNA含量处于不断上升和降低的震荡期，在盐处理12 h以后CbCBF1基因的相对mRNA含量具有明显的上调，在盐处理48 h时，CbCBF1基因的相对mRNA含量上调倍数达到10倍以上，72 h却有出现明显的下降，说明离子芥CbCBF1基因对盐胁迫较为敏感（图1）。
图1盐胁迫处理下，离子芥CbCBF1基因相对mRNA含量的变化2.2盐处理对CbCBF1翻译水平的调节性 Western-blot技术结果显示，CbCBF1蛋白的表达量在1～12 h均呈现出下降趋势，但整体维持在一个相对稳定的水平下，24 h开始上升，在48 h时时表达量则上调至最高点，72 h稍有回落，但仍然维持在一个较高的水平，说明CbCBF1在（图2）。
3结论与讨论
试验发现经过盐处理后，CbCBF1基因在转录和翻译水平的表达量均具有显著的变化，说明CbCBF1参与高山离子芥耐盐相关信号通路，响应盐胁迫。盐处理下，CbCBF1基因在前48 h内转录和翻译水平上的表达趋势相似，表明CbCBF1基因在响应盐胁迫的信号通路中可能作为次级信号。高山离子芥悬浮组织在150 mmol/L NaCl盐环境下随着时间会逐渐发白，盐处理72 h时提取的总蛋白浓度极低；而 圖2盐胁迫处理下离子芥CbCBF1蛋白表达量变化趋势及灰度分析图CbCBF1蛋白的表达量却依然在很高的水平。这说明CbCBF1基因可能参与细胞凋亡及组织坏死的信号调节网络[8]。
安徽农业科学2014年参考文献
[1] BADAWI M，DANYLUK J，BOUCHO B，et al.The CBF gene family in hexaploid wheat and its relationship to the phylogenetic complexity of cereal CBFs[J].Mol Genet Genomics，2007，277：533-554.
[2] GILMOUR S J，FOWLER S G，THOMASHOW M F.Arabidopsis transcriptional activators CBF1，CBF2，and CBF3 have matching functional activities[J].Plant Mol Biol，2004，54：767-781.
[3] GILMOUR S J，SEBOLT A M，SALAZARM P.Overexpression of the Arabidopsis CBF3 transcript ional activator mimics multiple biochemical changes associated with cold acclimation[J].Plant Physiol1，2000，24（4）：1854-1865.
[4] STEPONKUS P L.A contrast of the cryostability of the plasma membrane of winter rye and spring oat[M].London：JAI Press，1993：211-312.
[5] STOCKINGER E J，MAO Y，REGIER M K.Transcriptor adaptor and histone acetyltransferase proteins in Arabidopsis and their interactions with CBF1，a transcriptional activator involved in cold-regulated gene expression[J].Nucleic Acid Res，2000，29：1524-1533.
[6] STOCKINGER E J，GILMOURS S J，THOMASHOW M F.Arabidopsis thaliana CBF1 encodes an AP2 domain-containing transcriptional activator that binds to the Crepeat/DRE， a cis-acting DNA regulatory element that stimulates transcription in response to low temperature and water deficit[J].Proc Natl Acad Sci USA，1997，94：1035-1040.
[7] VOGEL J T，ZARKA D G，VAN BUSKIRK H A，et al.Roles of the CBF2 and ZAT12 transcription factors in configuring the low temperature transcriptome of Arabidopsis[J].Plant J，2005，41：195-211.
[8] GILMOUR S J，ZARKA D G，STOCKINGER E J，et al.Low temperature regulation of the Arabidopsis CBF family of AP2 transcriptional activators as an early step in cold induced COR gene expression[J].Plant J，1998，16：433-442.