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摘 要：以草鱼幼鱼为研究对象，用半致死浓度的嗜水气单胞菌感染鱼体，然后取病鱼和对照组的肝、脾、肾经Bouin’s液固定，石蜡包埋、切片、H.E染色，Nikon显微镜观察照相。结果表明：经过感染的鱼体肝、脾、肾都出现不同程度的肿大，肝脏灰白色，脾脏暗紫色。切片观察发现肝脏实质结构破坏明显，肝血管内血细胞减少，肝细胞肿胀、浑浊，空泡化；肾脏间质比例增大，肾小管和肾小体数量明显减少，肾小管上皮细胞肿胀、变性；脾脏内大量充血，脾脏淋巴细胞坏死，H.E染色发现大量的棕色“小结”充斥于整个脾脏之中。
关键词：嗜水气单胞菌；草鱼幼鱼；肝脏；脾脏；肾脏
中图分类号 S965.112 文献标识码 B 文章编号 1007-7731（2013）06-17-04
嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）广泛存在于自然界中受污染的水域及土壤，可分为致病性菌株和非致病性菌株。致病性菌株可感染鱼类等脊椎动物，临床上以急性出血性败血症为主要特征。慢性感染表现为皮肤溃疡或肠炎[1]。人感染后会发生腹泻或食物中毒，是一种典型人—兽—鱼共患病病原菌[2]，可直接影响人类的健康，给养殖业带来重大经济损失。
草鱼（Ctenopharyngodon idellus）属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属。因其生长快，饲料来源广，是深受群众喜爱的四大家鱼之一。研究嗜水气单胞菌对草鱼幼鱼肝、肾、脾的影响，可以为渔业生产、鱼病防治和诊断提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料 实验鱼选购于农贸市场，1龄健康草鱼种60尾。体重在34～66g，体长125～168mm，全长150～187mm。
1.2 实验方法 将购回的草鱼种放在34cm×21cm×25cm的玻璃缸中驯养，每天投喂少量饲料和定时换水。1周后开始实验。
1.2.1 菌液制备 （1）菌液来源：菌液来源于西南大学生命科学学院水产科学重点实验室；（2）菌种计数：将菌液稀释4倍与标准比浊管比浊计数，利用比浊计数法计算菌液浓度。
1.2.2 半致死浓度测定 （1）将40尾鱼随机分为4个实验组、1个对照组，每组8尾，分别喂养在34cm×21cm×25㎝的玻璃缸中。将水温维持在（25±1）℃。（2）将制备好的菌液分别用鱼用生理盐水稀释至109（组1）、108（组2）、107（组3）、106（组4）数量级浓度的菌液，然后每个实验组分别在背鳍基部注射相应浓度的菌液0.2mL。对照组（组5）注射鱼用生理盐水0.2mL。（3）观察鱼的活动状况，确定半致死浓度。
1.3 实验设计 将健康的16尾鱼分为1个实验组、1个对照组，每组8尾。实验组在背鳍基部注射0.2mL半致死浓度的菌液，对照组背鳍基部注射0.2mL生理盐水。从外形和活动状态观察，取染病初期和濒死个体的肝、脾、肾组织，及对照组草鱼肝、脾、肾组织用Bouin’s液固定，经石蜡包埋、切片、H.E染色，Nikon显微镜观察照相。
2 结果与分析
2.1 菌液计数 利用比浊计数法，得出标准曲线为y=28.453x-1.304 9（y为溶液浓度，x为溶液吸光度）。测得稀释4倍的菌液吸光度为0.436，根据标准曲线得到原嗜水气单胞菌液浓度为y=（28.453×0.436-1.304 9）×4cfu/mL，即4.44×109cfu/mL。
2.2 半致死浓度测定
2.2.1 病鱼症状 从外观上看，可见病鱼溃疡、腹水、败血等症状，接种初期出现红肿，鳞片无光泽，松动易脱落，继而肌肉组织溶解，且有液体渗出，皮肤向外隆起，有的在注射部位对侧也出现相应症状。濒死鱼注射部位皮肤、肌肉糜烂坏死，形成以溃疡和穿孔为特征的病变部位。感染鱼背部、腹鳍根部及眼睛有充血现象，剖开鱼腹腔，可见浑浊红色腹水流出，腥臭异味。肝、脾、肾肿大，肝脏呈灰白色，脾脏暗紫色，脾脏与相邻脏器相粘连，难以分离。
2.2.2 半致死浓度确定 人工感染实验总共进行了7d，前4d观察各实验组都出现鱼体背鳍基部红肿、鱼体游动缓慢等症状。实验组1 5d中死亡5尾，实验组2 7d死亡2尾，其它组在4～5d后患病鱼体红肿部位逐渐消失，病情好转，这可能是由于草鱼对嗜水气单胞菌具有天然抗性有关。实验过程中，注射了生理盐水的对照组鱼体外观特征无明显变化。根据试验数据，求得嗜水气单胞菌的半致死浓度为3.11×109cfu/mL。整个实验鱼体死亡情况见表1。
2.3 病鱼的组织切片观察
2.3.1 肝脏组织病理变化 正常、健康鱼肝脏的间质较少，肝小叶分界不明显，小叶外周的血窦常汇合成网，近小叶中心呈辐射排列；肝细胞圆形或略呈椭圆形，细胞排列紧密，肝血管内充满血细胞（图1）。染病的鱼肝脏外观颜色暗淡，略微肿大。从组织切片上看，较难分清肝脏的实质结构（图2）。肝细胞浑浊、肿胀，染病较重时，可见细胞核肿胀、空泡化、碎裂（图3）。病情严重时，大量肝细胞坏死、解体、胞质溢出，成浅红色一片。血细胞数量明显减少，肝细胞间有少量血细胞。
3 小结与讨论
20世纪70年代初，嗜水气单胞菌作为一种人类肠道病原菌，给人类健康带来危害，如导致人体急性腹泻，伤口感染现象时有发生；与其他菌一起引起人的胆囊炎、腹膜炎、脑膜炎、肺炎和体外创伤感染等；淡水鱼感染后，常表现为皮肤溃疡的慢性型病等，或是败血症急性死亡。如常见病有白鲢的“打印病”[3-4]，鲤鱼的红斑病、竖鳞病[5]，中华鳖的穿孔病、红脖子病[6-7]，异育银鲫的溶血性腹水病等[8-9]。
人工注射嗜水气单胞菌的病理变化主要表现为局部组织细胞的变性与坏死。病鱼发病初期，通常表现为注射部位的红肿充血。病原菌通过血液循环进入肝脏，使肝组织严重变性、坏死，机体的抵抗力迅速下降，继而病毒继续入侵，最终导致鱼体死亡。 组织切片观察结果发现，病鱼肝、脾、肾均有不同程度的病理变化，如细胞肿胀、变性及坏死。肝细胞索结构模糊，实质结构受损，中央静脉和肝血窦普遍缺血，肝细胞空泡化严重等。肾间质比例增大，肾小管上皮细胞肿胀，肾小体和肾小管数量明显减少，管腔界限不清，出现轻微的空泡变性。脾脏肿胀明显，组织大量出血，H.E染色观察可见大量的棕黄色“小结”现象。这些特征与杜雄伟等[10]研究的嗜水气单胞菌感染剑尾鱼造成的肝、脾、肾的病理变化相似，这表明嗜水气单胞菌对不同鱼体的组织病理学感染具有相似性。但与米瑞芙等[11]对白鲢出血性败血症研究有差异，这表明嗜水气单胞菌对不同的鱼类损伤也是有差异的，也可能是由于不同鱼体对病菌的入侵抵抗力不同有关。
在观察病变组织时，发现染病鱼体的肝、肾、脾中均存在棕黄色的“小结”，且以脾脏中较多。王铁辉等[12]对稀有鮈鲫出血病的研究认为，在脾脏中出现的大量棕色“小结”可能是衰老的红血球。因脾脏是鱼体的造血和灭血器官，血窦中有红血球和巨噬细胞等。正常脾脏中巨噬细胞可以吞噬衰老的红细胞，分解血红蛋白后便可形成棕色“小结”。而当病鱼脾脏组织受损时，巨噬细胞便聚集在一起，吞噬红细胞并分解血红蛋白形成棕色的“小结”。因此在病鱼脾脏中会出现棕色“小结”增多的现象。
参考文献
[1]GB/T 18652—2002，中华人民共和国国家标准《致病性嗜水气单胞菌检验方法》[S].
[2]吕爱军，李任年，余为一.嗜温气单胞菌研究进展[J].中国动物检疫，2000，11：42-43.
[3]何顺华，傅锦楠，龚小华，等.白鲢出血病病原菌的鉴定[J].水产科技情报，1993，20（2）：75-77.
[4]徐伯亥.鲢、鳙鱼流行性传染病的流行病学和细菌病因的初步研究[J].水产科技情报，1999，3：288-289.
[5]陈怀青，陆承平.家养鲤科鱼暴发性传染病的病原研究[J].南京农业大学学报，1991，14（4）：87-91.
[6]孙佩芳，蔡完其，吴建农，等.鳖穿孔病的病原研究[J].水产学报，1996，20（2）：120-124.
[7]齐彩霞，魏于生.鳖穿孔病的病原苗及其防治的研究[J].鱼类病害研究，1997，19（1）：44-46.
[8]孙其涣，孙佩芳，金丽华，等.异育银鲫溶血性腹水病病原的研究[J].水产学报，1991，15（2）：130-139.
[9]黄琪琰.异育银鲫溶血性腹水病的病理生理研究[J].水产学报，1992，16（4）：316-321.
[10]杜雄伟，常藕琴，王晓辉，等.嗜水气单胞菌对剑尾鱼的致病性及组织病理学研究[J].长江大学学报，2005，2（2）：53-57.
[11]米瑞芙，谢宝华，陶炳春，等.白鲢出血性败血症病理组织学研究[J].动物学杂志，1994，29（1）：18-20.
[12]王铁辉，刘沛霖，陈宏溪，等.稀有鮈鲫对草鱼出血病病毒敏感性的初步研究[J].水生生物学报，1994，18（2）：144-149.
（责编：徐世红）
关键词：嗜水气单胞菌；草鱼幼鱼；肝脏；脾脏；肾脏
中图分类号 S965.112 文献标识码 B 文章编号 1007-7731（2013）06-17-04
嗜水气单胞菌（Aeromonas hydrophila）广泛存在于自然界中受污染的水域及土壤，可分为致病性菌株和非致病性菌株。致病性菌株可感染鱼类等脊椎动物，临床上以急性出血性败血症为主要特征。慢性感染表现为皮肤溃疡或肠炎[1]。人感染后会发生腹泻或食物中毒，是一种典型人—兽—鱼共患病病原菌[2]，可直接影响人类的健康，给养殖业带来重大经济损失。
草鱼（Ctenopharyngodon idellus）属鲤形目鲤科雅罗鱼亚科草鱼属。因其生长快，饲料来源广，是深受群众喜爱的四大家鱼之一。研究嗜水气单胞菌对草鱼幼鱼肝、肾、脾的影响，可以为渔业生产、鱼病防治和诊断提供参考。
1 材料与方法
1.1 实验材料 实验鱼选购于农贸市场，1龄健康草鱼种60尾。体重在34～66g，体长125～168mm，全长150～187mm。
1.2 实验方法 将购回的草鱼种放在34cm×21cm×25cm的玻璃缸中驯养，每天投喂少量饲料和定时换水。1周后开始实验。
1.2.1 菌液制备 （1）菌液来源：菌液来源于西南大学生命科学学院水产科学重点实验室；（2）菌种计数：将菌液稀释4倍与标准比浊管比浊计数，利用比浊计数法计算菌液浓度。
1.2.2 半致死浓度测定 （1）将40尾鱼随机分为4个实验组、1个对照组，每组8尾，分别喂养在34cm×21cm×25㎝的玻璃缸中。将水温维持在（25±1）℃。（2）将制备好的菌液分别用鱼用生理盐水稀释至109（组1）、108（组2）、107（组3）、106（组4）数量级浓度的菌液，然后每个实验组分别在背鳍基部注射相应浓度的菌液0.2mL。对照组（组5）注射鱼用生理盐水0.2mL。（3）观察鱼的活动状况，确定半致死浓度。
1.3 实验设计 将健康的16尾鱼分为1个实验组、1个对照组，每组8尾。实验组在背鳍基部注射0.2mL半致死浓度的菌液，对照组背鳍基部注射0.2mL生理盐水。从外形和活动状态观察，取染病初期和濒死个体的肝、脾、肾组织，及对照组草鱼肝、脾、肾组织用Bouin’s液固定，经石蜡包埋、切片、H.E染色，Nikon显微镜观察照相。
2 结果与分析
2.1 菌液计数 利用比浊计数法，得出标准曲线为y=28.453x-1.304 9（y为溶液浓度，x为溶液吸光度）。测得稀释4倍的菌液吸光度为0.436，根据标准曲线得到原嗜水气单胞菌液浓度为y=（28.453×0.436-1.304 9）×4cfu/mL，即4.44×109cfu/mL。
2.2 半致死浓度测定
2.2.1 病鱼症状 从外观上看，可见病鱼溃疡、腹水、败血等症状，接种初期出现红肿，鳞片无光泽，松动易脱落，继而肌肉组织溶解，且有液体渗出，皮肤向外隆起，有的在注射部位对侧也出现相应症状。濒死鱼注射部位皮肤、肌肉糜烂坏死，形成以溃疡和穿孔为特征的病变部位。感染鱼背部、腹鳍根部及眼睛有充血现象，剖开鱼腹腔，可见浑浊红色腹水流出，腥臭异味。肝、脾、肾肿大，肝脏呈灰白色，脾脏暗紫色，脾脏与相邻脏器相粘连，难以分离。
2.2.2 半致死浓度确定 人工感染实验总共进行了7d，前4d观察各实验组都出现鱼体背鳍基部红肿、鱼体游动缓慢等症状。实验组1 5d中死亡5尾，实验组2 7d死亡2尾，其它组在4～5d后患病鱼体红肿部位逐渐消失，病情好转，这可能是由于草鱼对嗜水气单胞菌具有天然抗性有关。实验过程中，注射了生理盐水的对照组鱼体外观特征无明显变化。根据试验数据，求得嗜水气单胞菌的半致死浓度为3.11×109cfu/mL。整个实验鱼体死亡情况见表1。
2.3 病鱼的组织切片观察
2.3.1 肝脏组织病理变化 正常、健康鱼肝脏的间质较少，肝小叶分界不明显，小叶外周的血窦常汇合成网，近小叶中心呈辐射排列；肝细胞圆形或略呈椭圆形，细胞排列紧密，肝血管内充满血细胞（图1）。染病的鱼肝脏外观颜色暗淡，略微肿大。从组织切片上看，较难分清肝脏的实质结构（图2）。肝细胞浑浊、肿胀，染病较重时，可见细胞核肿胀、空泡化、碎裂（图3）。病情严重时，大量肝细胞坏死、解体、胞质溢出，成浅红色一片。血细胞数量明显减少，肝细胞间有少量血细胞。
3 小结与讨论
20世纪70年代初，嗜水气单胞菌作为一种人类肠道病原菌，给人类健康带来危害，如导致人体急性腹泻，伤口感染现象时有发生；与其他菌一起引起人的胆囊炎、腹膜炎、脑膜炎、肺炎和体外创伤感染等；淡水鱼感染后，常表现为皮肤溃疡的慢性型病等，或是败血症急性死亡。如常见病有白鲢的“打印病”[3-4]，鲤鱼的红斑病、竖鳞病[5]，中华鳖的穿孔病、红脖子病[6-7]，异育银鲫的溶血性腹水病等[8-9]。
人工注射嗜水气单胞菌的病理变化主要表现为局部组织细胞的变性与坏死。病鱼发病初期，通常表现为注射部位的红肿充血。病原菌通过血液循环进入肝脏，使肝组织严重变性、坏死，机体的抵抗力迅速下降，继而病毒继续入侵，最终导致鱼体死亡。 组织切片观察结果发现，病鱼肝、脾、肾均有不同程度的病理变化，如细胞肿胀、变性及坏死。肝细胞索结构模糊，实质结构受损，中央静脉和肝血窦普遍缺血，肝细胞空泡化严重等。肾间质比例增大，肾小管上皮细胞肿胀，肾小体和肾小管数量明显减少，管腔界限不清，出现轻微的空泡变性。脾脏肿胀明显，组织大量出血，H.E染色观察可见大量的棕黄色“小结”现象。这些特征与杜雄伟等[10]研究的嗜水气单胞菌感染剑尾鱼造成的肝、脾、肾的病理变化相似，这表明嗜水气单胞菌对不同鱼体的组织病理学感染具有相似性。但与米瑞芙等[11]对白鲢出血性败血症研究有差异，这表明嗜水气单胞菌对不同的鱼类损伤也是有差异的，也可能是由于不同鱼体对病菌的入侵抵抗力不同有关。
在观察病变组织时，发现染病鱼体的肝、肾、脾中均存在棕黄色的“小结”，且以脾脏中较多。王铁辉等[12]对稀有鮈鲫出血病的研究认为，在脾脏中出现的大量棕色“小结”可能是衰老的红血球。因脾脏是鱼体的造血和灭血器官，血窦中有红血球和巨噬细胞等。正常脾脏中巨噬细胞可以吞噬衰老的红细胞，分解血红蛋白后便可形成棕色“小结”。而当病鱼脾脏组织受损时，巨噬细胞便聚集在一起，吞噬红细胞并分解血红蛋白形成棕色的“小结”。因此在病鱼脾脏中会出现棕色“小结”增多的现象。
参考文献
[1]GB/T 18652—2002，中华人民共和国国家标准《致病性嗜水气单胞菌检验方法》[S].
[2]吕爱军，李任年，余为一.嗜温气单胞菌研究进展[J].中国动物检疫，2000，11：42-43.
[3]何顺华，傅锦楠，龚小华，等.白鲢出血病病原菌的鉴定[J].水产科技情报，1993，20（2）：75-77.
[4]徐伯亥.鲢、鳙鱼流行性传染病的流行病学和细菌病因的初步研究[J].水产科技情报，1999，3：288-289.
[5]陈怀青，陆承平.家养鲤科鱼暴发性传染病的病原研究[J].南京农业大学学报，1991，14（4）：87-91.
[6]孙佩芳，蔡完其，吴建农，等.鳖穿孔病的病原研究[J].水产学报，1996，20（2）：120-124.
[7]齐彩霞，魏于生.鳖穿孔病的病原苗及其防治的研究[J].鱼类病害研究，1997，19（1）：44-46.
[8]孙其涣，孙佩芳，金丽华，等.异育银鲫溶血性腹水病病原的研究[J].水产学报，1991，15（2）：130-139.
[9]黄琪琰.异育银鲫溶血性腹水病的病理生理研究[J].水产学报，1992，16（4）：316-321.
[10]杜雄伟，常藕琴，王晓辉，等.嗜水气单胞菌对剑尾鱼的致病性及组织病理学研究[J].长江大学学报，2005，2（2）：53-57.
[11]米瑞芙，谢宝华，陶炳春，等.白鲢出血性败血症病理组织学研究[J].动物学杂志，1994，29（1）：18-20.
[12]王铁辉，刘沛霖，陈宏溪，等.稀有鮈鲫对草鱼出血病病毒敏感性的初步研究[J].水生生物学报，1994，18（2）：144-149.
（责编：徐世红）