【摘 要】
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目的:扩增高致病性禽流感H5N1亚型病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因,并进行真核表达.方法:抽提毒株A/Jiangsu/08-6基因组RNA,反转录为cDNA,用特异性引物扩增HA基因.HA经BamH
【机 构】
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南京医科大学卫生部抗体技术重点实验室,江苏南京,210029;卫生部肠道病原微生物重点实验室,江苏省疾病预防控中心病原微生物研究所,江苏南京210009
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目的:扩增高致病性禽流感H5N1亚型病毒血凝素(hemagglutinin,HA)基因,并进行真核表达.方法:抽提毒株A/Jiangsu/08-6基因组RNA,反转录为cDNA,用特异性引物扩增HA基因.HA经BamH I/Xho I双酶切后克隆到pFastBacGP67B载体上,筛选出阳性重组转座质粒pFastBac-GP67B-HA,并将其进一步转化DH 10Bac感受态细胞,通过蓝白斑筛选和PCR鉴定后,获得重组穿梭载体(rBacmid-HA),再通过CellfectinⅡ试剂转染rBacmid-HA至对数生长期的sf9昆虫细胞,进行目的蛋白的真核表达.分别用SDS-PAGE、Western blot、血凝试验以及质谱分析对其进行鉴定.结果:HA基因在sf9细胞表达的蛋白分子量约70 000.血凝试验表明重组HA蛋白可使鸡红细胞发生凝集.质谱分析鉴定该重组蛋白为HA蛋白.结论:重组HA蛋白具有天然HA蛋白的活性,为亚单位疫苗的研制及中和抗体的筛选奠定了基础.
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