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摘 要：以100 mmol浓度NaCl盐胁迫，对转OsEBP-89基因水稻T6代3个株系芽期与幼苗期抗盐性进行了鉴定。结果表明，转OsEBP-89基因株系之间抗盐性存在差异，其中两个转基因株系（3448和3463）发芽势比对照日本晴高，芽期综合相对盐害率显著低于对照日本晴，说明转基因材料在100 mmol NaCl胁迫下其芽受到盐的伤害少于对照材料；但其发芽率、根长、苗高和幼苗期综合相对盐害率与对照日本晴没有显著差异。
关键词：水稻；OsEBP-89基因；抗盐性；芽期；幼苗期
中图分类号：S511 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.10.001
Salt Tolerance of OsEBP-89 Transgenic Rice in Germination Period and Early Seedling Stage
SONU Songjin1，2， YIN You-wei1， FENG Meng-shi1， ZHANG Bing-wei1， ZHANG Chang-quan1， YU Heng-xiu1
（1.Jiangsu Key Laboratory of Crop Genetics and Physiology/Co-Innovation Center for Modern Production Technology of Grain Crops， Key Laboratory of Plant Functional Genomics of the Ministry of Education， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225009， China； 2. Kim Il Sung University Pyongyang Agricultural Campus， Pyongyang， DPR of Korea）
Abstract： The salt tolerance of OsEBP-89 transgenic rice in the germination period and early seedling stage was studied in the condition of 100 mmol NaCl concentration. The results showed that the germination vigor of the two transgenic lines （3448 and 3463） was higher than the wild-type. The relative salt damage rate of these two transgenic lines in germinating period is lower than the contrast. But there is no significant difference in germination rate， root length and seedling height and relative salt damage rate of early seedling stage between transgenic lines and the wild-type.
Key words： rice； OsEBP-89 gene；salt tolerance；germination period；seedling stage
盐害是世界上最严重的环境问题之一。全球20%的耕地和近半数的灌溉土地都受到不同程度的盐害威胁。水稻属于不抗盐植物， 土壤的盐害影响使其产量难以提高[1-3]。因此， 对水稻抗盐性的研究与改良非常重要。提高水稻抗盐能力的方法主要是培育抗盐品种， 而基因工程技术是快速实现这一目的的有力工具[4-6]。OsEBP-89基因是水稻中一个EREBP（Ethylene responsive elements binding protein）类转录因子[7-8]。AP2/EERBP转录因子在花发育和逆境胁迫应答过程中起重要作用。根据该家族基因所含的AP2/EREBP结构域的数目不同可将其分为两类：AP2和EREBP亚家族[9]。AP2亚家族含有两个正向重复的AP2结构域，主要调控细胞的生长发育；EREBP 亚族含有一个AP2-DNA结合域，主要调节植物对激素、病原、逆境等的响应。许多外界条件，如乙烯、盐、伤害、低温和干旱等能诱导EREBP亚类家族基因的表达，使植物抗性和耐性提高[9-10]。已有的研究表明OsEBP-89基因参与了乙烯调控的水稻胁迫反应和种子成熟过程，该基因的表达受激素及其类似物ACC、2，4-D、ABA、BR、JA、GA 和6-BA 的诱导，此外也受盐胁迫的诱导[8，11-12]。用 NaCl 处理，OsEBP-89基因的表达在处理2 h 后有所升高，此后稍有变化[11]。但是关于转OsEBP-89基因水稻幼苗抗盐性研究还没有报道。本试验通过对转OsEBP-89基因水稻T6代种子进行盐胁迫下的发芽试验，研究其芽期及幼苗期的抗盐能力，为进一步研究OsEBP-89基因与水稻抗逆的关系提供依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料
本试验用了3个转OsEBP-89基因水稻株系3448，3463和3464及其受体亲本日本晴。
1.2 试验方法
1.2.1 转育水稻纯系的分子鉴定 从同一个转基因株系来源的不同个体后代中各选择16个单株，按CTAB法提取叶片总DNA。然后用PCR的方法鉴定纯合转基因水稻。对转基因株系鉴定的PCR扩增的5’和3’端引物分别为与OsEBP-89基因片段编码区和Ubi启动子区互补，分别为BP89（5’-GGGGACGACACACATGACAC-3’）和 Ubi-F3（5’-CTGATG CATATACATGATGG-3’）。PCR产物大小为520 bp，反应条件为：95 ℃，5 min； 95 ℃，35 s；55 ℃，35 s；72 ℃，35 s；循环35 次；72 ℃，8 min。在1%的琼脂糖凝胶上电泳，通过紫外照射仪观察结果。 1.2.2 种子萌发试验 每份材料挑选50 粒饱满的种子， 置于垫有滤纸的口径为9 cm 的培养皿中。先用3%的次氯酸钠溶液处理， 消毒20 min， 然后用自来水冲洗6次。NaCl（分析纯）胁迫浓度设0（ 蒸馏水） ，100 mmol两个水平。发芽期和幼苗期调查性状包括发芽势、发芽率、根数、根长和苗高。在培养皿里分别加入上述2个处理溶液10 mL，加盖后放入28 ℃ 恒温光照箱中催芽。盐胁迫处理后的第3 天和第7天，以水稻种子的芽长和根长等于2 mm为发芽标准[13] ， 分别调查种子的发芽粒数， 并计算发芽势和发芽率及其相对盐害率。然后， 将装有发芽水稻种子的培养皿放置于温度为28 ℃ 的恒温的光照箱环境， 再继续生长3 d后每个处理随机选取10 株， 测量其根数、根长和苗高，并计算相应的相对盐害率。在恒温箱内催芽和幼苗生长期间， 每天定时更换一次盐液。试验重复3 次。以相对盐害率的大小来评价水稻发芽期和幼苗期耐盐性的强弱，相对盐害率的计算方法如下。
1.3 数据处理
试验所得数据使用Microsoft Excel 2007及spss17.0 软件进行统计计算。
2 结果与分析
2.1 转OsEBP-89基因纯合株系的分子检测
为检测转基因株系是否为纯系，从每一个转基因株系来源的后代中各选择16个单株，按CTAB法提取叶片总DNA，然后分别利用PCR检测目的基因。图1 所示为3463株系中16个单株的PCR扩增结果，均能特异性扩增出520 bp的目的片段，说明该株系为含有OsEBP-89基因的纯合株系。3448和3464株系也有同样的PCR扩增结果，证明3448和3464株系也为转OsEBP-89基因的纯合株系。
2.2 转基因水稻及对照的发芽势和发芽率
在100 mmol NaCl处理条件下转基因株系及对照的芽期发芽势和发芽率见表1，对发芽势来说转基因株系之间存在明显的差异，两个转基因株系3463和3448的发芽势分别为78.5%和70.4%，明显高于对照（3447）的41.5%。而另一个转基因株系（3464）与对照的发芽势之间没有明显的差异。但发芽率在转基因水稻和未转化对照间无显著差异。
2.3 转基因水稻及其对照幼苗期性状表现
为进一步研究OsEBP-89基因的表达对水稻幼苗生长的影响，测定了幼苗前期的相关性状并进行了比较，结果见表2。在100 mmol NaCl浓度条件下，转基因株系及对照的根长与苗高之间不存在显著差异，但对照日本晴的根数明显多于转基因水稻。
2.4 转基因水稻及对照的芽期及幼苗期综合相对盐害率的比较
对转基因株系及其对照芽期及幼苗期综合相对盐害率进行比较，结果见表3。3448株系和3463株系的芽期综合相对盐害率分别为35.9%和34.9%，低于对照的52.0%，这说明在100 mmol NaCl 胁迫条件下，芽期转基因株系的耐盐能力高于对照。转基因株系的幼苗期综合相对盐害率与对照无显著差异。
3 结论与讨论
本研究在100 mmol NaCl浓度胁迫条件下进行转OsEBP-89基因株系及对照材料的发芽试验，测定不同材料的发芽势、发芽率、根数、根长及苗高，并计算其芽期与幼苗前期综合相对盐害率。结论如下。
（1）芽期转OsEBP-89基因株系之间抗盐性存在差异，其中两个转基因株系（3448和3463）发芽势比对照日本晴高，芽期综合相对盐害率显著低于对照日本晴，说明OsEBP-89基因的表达可能与转基因株系的芽期抗盐性有关。
（2）幼苗期转OsEBP-89基因株系的发芽率、根长、苗高和幼苗期综合相对盐害率与对照日本晴没有显著差异。
OsEBP-89基因是水稻中一个EREBP类转录因子。通过序列比较在OsEBP-89基因启动子区找到一个类似乙烯应答元件（Ethylene responsive element， ERE），称为IVC box。ERE元件是除了GCC box 和C/DRE box 外，又一个应答乙烯信号的元件。ERE元件是在与果实成熟相关的基因启动子中发现的，它能够应答乙烯，促进果实的成熟。在OsEBP-89基因启动区还存在可能参与乙烯应答的另一个C/DRE元件[11]。C/DRE元件是与抗胁迫相关的元件。与DRE （Dehydration responsive element）顺式元件特异性结合的DREB（Dehydration responsive element binding）转录因子，也是EREBP类转录因子。DREB是植物中特有的与低温、高盐和干旱胁迫相关的转录因子， 可以调控启动子中含有DRE元件的一类逆境响应基因的表达[14-15]。Northern杂交也确实检测出OsEBP-89基因的表达受激素及其类似物ACC、2，4-D、ABA、BR、JA、GA 和6-BA 的诱导，此外也受盐胁迫的诱导[11-12]。陈芬等[16]对两系杂交水稻不育系4008S的转DREB 1A基因株系与非转基因水稻对照品种进行了干旱胁迫处理，证明DREB1A 基因可以提高水稻对干旱胁迫的耐受性。包永霞等[17]的研究结果也表明，转DREB1A基因可以明显提高多年生黑麦草萌发期的耐盐性。OsEBP-89基因和DREB类基因都受盐胁迫的诱导，但OsEBP-89基因还受很多激素及其类似物的诱导，参与了很多方面的调控。因此，可能是OsEBP-89参与盐胁迫的一些关键代谢过程的特异性比较低，导致转OsEBP-89基因水稻抗盐性表现的时间比较早而短。
参考文献：
[1] 任昱坤，吴雪峰，谢亚军. 植物抗盐性研究进展的综述[J]. 宁夏农学院学报，1995， 16 （4）： 60-66.
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[13] 祁栋灵，韩龙植，张三元. 水稻耐盐性鉴定评价方法[J]. 植物遗传资源学报， 2005， 6（ 2） ： 226-230.
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[15] 刘强，赵南明，Yamaguchi-Shinozaki K， et al. DREB转录因子在提高 植物抗逆性中的作用[J]. 科学通报， 2000， 45（1）：11-16.
[16] 陈芬，杜洪伟，陈浩东，等. 干旱响应转录因子DREB1A基因导入水稻光温敏核不育系的研究 [J] . 生命科学研究，2008（12）：24-28.
[17] 包永霞，李雪，满达，等. 转DREB1A基因多年生黑麦草T1代萌发期耐盐性研究[J]. 草业科学，2011，28（8）：1 440-1 444.
关键词：水稻；OsEBP-89基因；抗盐性；芽期；幼苗期
中图分类号：S511 文献标识码：A DOI 编码：10.3969/j.issn.1006-6500.2014.10.001
Salt Tolerance of OsEBP-89 Transgenic Rice in Germination Period and Early Seedling Stage
SONU Songjin1，2， YIN You-wei1， FENG Meng-shi1， ZHANG Bing-wei1， ZHANG Chang-quan1， YU Heng-xiu1
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Abstract： The salt tolerance of OsEBP-89 transgenic rice in the germination period and early seedling stage was studied in the condition of 100 mmol NaCl concentration. The results showed that the germination vigor of the two transgenic lines （3448 and 3463） was higher than the wild-type. The relative salt damage rate of these two transgenic lines in germinating period is lower than the contrast. But there is no significant difference in germination rate， root length and seedling height and relative salt damage rate of early seedling stage between transgenic lines and the wild-type.
Key words： rice； OsEBP-89 gene；salt tolerance；germination period；seedling stage
盐害是世界上最严重的环境问题之一。全球20%的耕地和近半数的灌溉土地都受到不同程度的盐害威胁。水稻属于不抗盐植物， 土壤的盐害影响使其产量难以提高[1-3]。因此， 对水稻抗盐性的研究与改良非常重要。提高水稻抗盐能力的方法主要是培育抗盐品种， 而基因工程技术是快速实现这一目的的有力工具[4-6]。OsEBP-89基因是水稻中一个EREBP（Ethylene responsive elements binding protein）类转录因子[7-8]。AP2/EERBP转录因子在花发育和逆境胁迫应答过程中起重要作用。根据该家族基因所含的AP2/EREBP结构域的数目不同可将其分为两类：AP2和EREBP亚家族[9]。AP2亚家族含有两个正向重复的AP2结构域，主要调控细胞的生长发育；EREBP 亚族含有一个AP2-DNA结合域，主要调节植物对激素、病原、逆境等的响应。许多外界条件，如乙烯、盐、伤害、低温和干旱等能诱导EREBP亚类家族基因的表达，使植物抗性和耐性提高[9-10]。已有的研究表明OsEBP-89基因参与了乙烯调控的水稻胁迫反应和种子成熟过程，该基因的表达受激素及其类似物ACC、2，4-D、ABA、BR、JA、GA 和6-BA 的诱导，此外也受盐胁迫的诱导[8，11-12]。用 NaCl 处理，OsEBP-89基因的表达在处理2 h 后有所升高，此后稍有变化[11]。但是关于转OsEBP-89基因水稻幼苗抗盐性研究还没有报道。本试验通过对转OsEBP-89基因水稻T6代种子进行盐胁迫下的发芽试验，研究其芽期及幼苗期的抗盐能力，为进一步研究OsEBP-89基因与水稻抗逆的关系提供依据。
1 材料和方法
1.1 试验材料
本试验用了3个转OsEBP-89基因水稻株系3448，3463和3464及其受体亲本日本晴。
1.2 试验方法
1.2.1 转育水稻纯系的分子鉴定 从同一个转基因株系来源的不同个体后代中各选择16个单株，按CTAB法提取叶片总DNA。然后用PCR的方法鉴定纯合转基因水稻。对转基因株系鉴定的PCR扩增的5’和3’端引物分别为与OsEBP-89基因片段编码区和Ubi启动子区互补，分别为BP89（5’-GGGGACGACACACATGACAC-3’）和 Ubi-F3（5’-CTGATG CATATACATGATGG-3’）。PCR产物大小为520 bp，反应条件为：95 ℃，5 min； 95 ℃，35 s；55 ℃，35 s；72 ℃，35 s；循环35 次；72 ℃，8 min。在1%的琼脂糖凝胶上电泳，通过紫外照射仪观察结果。 1.2.2 种子萌发试验 每份材料挑选50 粒饱满的种子， 置于垫有滤纸的口径为9 cm 的培养皿中。先用3%的次氯酸钠溶液处理， 消毒20 min， 然后用自来水冲洗6次。NaCl（分析纯）胁迫浓度设0（ 蒸馏水） ，100 mmol两个水平。发芽期和幼苗期调查性状包括发芽势、发芽率、根数、根长和苗高。在培养皿里分别加入上述2个处理溶液10 mL，加盖后放入28 ℃ 恒温光照箱中催芽。盐胁迫处理后的第3 天和第7天，以水稻种子的芽长和根长等于2 mm为发芽标准[13] ， 分别调查种子的发芽粒数， 并计算发芽势和发芽率及其相对盐害率。然后， 将装有发芽水稻种子的培养皿放置于温度为28 ℃ 的恒温的光照箱环境， 再继续生长3 d后每个处理随机选取10 株， 测量其根数、根长和苗高，并计算相应的相对盐害率。在恒温箱内催芽和幼苗生长期间， 每天定时更换一次盐液。试验重复3 次。以相对盐害率的大小来评价水稻发芽期和幼苗期耐盐性的强弱，相对盐害率的计算方法如下。
1.3 数据处理
试验所得数据使用Microsoft Excel 2007及spss17.0 软件进行统计计算。
2 结果与分析
2.1 转OsEBP-89基因纯合株系的分子检测
为检测转基因株系是否为纯系，从每一个转基因株系来源的后代中各选择16个单株，按CTAB法提取叶片总DNA，然后分别利用PCR检测目的基因。图1 所示为3463株系中16个单株的PCR扩增结果，均能特异性扩增出520 bp的目的片段，说明该株系为含有OsEBP-89基因的纯合株系。3448和3464株系也有同样的PCR扩增结果，证明3448和3464株系也为转OsEBP-89基因的纯合株系。
2.2 转基因水稻及对照的发芽势和发芽率
在100 mmol NaCl处理条件下转基因株系及对照的芽期发芽势和发芽率见表1，对发芽势来说转基因株系之间存在明显的差异，两个转基因株系3463和3448的发芽势分别为78.5%和70.4%，明显高于对照（3447）的41.5%。而另一个转基因株系（3464）与对照的发芽势之间没有明显的差异。但发芽率在转基因水稻和未转化对照间无显著差异。
2.3 转基因水稻及其对照幼苗期性状表现
为进一步研究OsEBP-89基因的表达对水稻幼苗生长的影响，测定了幼苗前期的相关性状并进行了比较，结果见表2。在100 mmol NaCl浓度条件下，转基因株系及对照的根长与苗高之间不存在显著差异，但对照日本晴的根数明显多于转基因水稻。
2.4 转基因水稻及对照的芽期及幼苗期综合相对盐害率的比较
对转基因株系及其对照芽期及幼苗期综合相对盐害率进行比较，结果见表3。3448株系和3463株系的芽期综合相对盐害率分别为35.9%和34.9%，低于对照的52.0%，这说明在100 mmol NaCl 胁迫条件下，芽期转基因株系的耐盐能力高于对照。转基因株系的幼苗期综合相对盐害率与对照无显著差异。
3 结论与讨论
本研究在100 mmol NaCl浓度胁迫条件下进行转OsEBP-89基因株系及对照材料的发芽试验，测定不同材料的发芽势、发芽率、根数、根长及苗高，并计算其芽期与幼苗前期综合相对盐害率。结论如下。
（1）芽期转OsEBP-89基因株系之间抗盐性存在差异，其中两个转基因株系（3448和3463）发芽势比对照日本晴高，芽期综合相对盐害率显著低于对照日本晴，说明OsEBP-89基因的表达可能与转基因株系的芽期抗盐性有关。
（2）幼苗期转OsEBP-89基因株系的发芽率、根长、苗高和幼苗期综合相对盐害率与对照日本晴没有显著差异。
OsEBP-89基因是水稻中一个EREBP类转录因子。通过序列比较在OsEBP-89基因启动子区找到一个类似乙烯应答元件（Ethylene responsive element， ERE），称为IVC box。ERE元件是除了GCC box 和C/DRE box 外，又一个应答乙烯信号的元件。ERE元件是在与果实成熟相关的基因启动子中发现的，它能够应答乙烯，促进果实的成熟。在OsEBP-89基因启动区还存在可能参与乙烯应答的另一个C/DRE元件[11]。C/DRE元件是与抗胁迫相关的元件。与DRE （Dehydration responsive element）顺式元件特异性结合的DREB（Dehydration responsive element binding）转录因子，也是EREBP类转录因子。DREB是植物中特有的与低温、高盐和干旱胁迫相关的转录因子， 可以调控启动子中含有DRE元件的一类逆境响应基因的表达[14-15]。Northern杂交也确实检测出OsEBP-89基因的表达受激素及其类似物ACC、2，4-D、ABA、BR、JA、GA 和6-BA 的诱导，此外也受盐胁迫的诱导[11-12]。陈芬等[16]对两系杂交水稻不育系4008S的转DREB 1A基因株系与非转基因水稻对照品种进行了干旱胁迫处理，证明DREB1A 基因可以提高水稻对干旱胁迫的耐受性。包永霞等[17]的研究结果也表明，转DREB1A基因可以明显提高多年生黑麦草萌发期的耐盐性。OsEBP-89基因和DREB类基因都受盐胁迫的诱导，但OsEBP-89基因还受很多激素及其类似物的诱导，参与了很多方面的调控。因此，可能是OsEBP-89参与盐胁迫的一些关键代谢过程的特异性比较低，导致转OsEBP-89基因水稻抗盐性表现的时间比较早而短。
参考文献：
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