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摘要：目的：应用Box-Behnken效应面法优化鹿衔草多糖提取工艺，并研究其抗氧化活性。方法：在单因素实验基础上，以多糖提取率（Y）为评价指标，加水量（X1）、浸提时间（X2）和提取温度（X3）为考察对象，利用星点设计效应面法优化鹿蹄草多糖提取工艺，观察其对二苯基苦基苯肼自由基（·DPPH）的清除作用。结果：优化后的最佳工艺为加水量24.9倍，提取时间146.5min，提取温度100°C，最佳提取工艺下鹿衔草多糖提取率达3.57%±1.56%，5 mg/mL的浓度就对DPPH的抑制达到80%以上。结论：Box-Behnken效应面法优化鹿衔草多糖提取工艺方法可行，鹿衔草多糖有一定的抗氧化活性。
关键词：多糖；鹿衔草；响应面法；抗氧化
鹿衔草又名鹿蹄草，鹿寿草，是鹿蹄草科（Pyrolaceae）鹿蹄草属（Pyrola）植物鹿蹄草（Pyrola calliantha H. Andres）或普通鹿蹄草（Pyrola decorate H. Andres）的干燥全草[1]。具有祛风湿，强筋骨，止血，止咳。临床上常用于风湿痹痛，肾虚腰痛，腰膝无力，月经过多，久咳劳嗽。现代药理研究表明鹿衔草含黄酮类[2-3]、酚苷类[4]、醌类[5]、萜类[6]、多糖[7-9]等化学成分，具有抗菌、抗炎、对心血管系统作用、抗氧化[10-11]、抗肿瘤等多种药理作用[12]。目前关于鹿衔草黄酮和多酚的抗氧化研究报道较多，随着对多糖类成分抗氧化的研究日益增多，也有部分关于多糖提取的研究报道，但对鹿衔草抗氧化的研究还比较少，因而研究其提取工艺和抗氧化活性更加重要。
星点设计（central composite design，CCD）是常用的一种由于提取工艺优化的设计方法，在中药提取工艺研究中广泛使用[13]。之前已有应用正交设计研究水提取、碱水提取和酶法提取结合醇沉法制备鹿衔草多糖的工艺研究[7-8]，因此我们选用水作为提取溶剂，在单因素实验基础上，采用星点设计法安排提取实验，结合响应面法优化鹿衔草多糖提取工艺并对其抗氧化活性进行研究，以期为鹿衔草的开发应用提供依据和参考。
1 材料与仪器
鹿衔草药材（购于陕西太白县）。D-无水葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究所），浓硫酸、苯酚、乙醇等均为分析纯；实验用水为纯化水。
Autoscience AS 5150A超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司），电热式恒温水浴锅（江苏金坛宏凯仪器厂），RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），LXJ-Ⅱ离心沉淀机（上海医用分析仪器厂），ME104电子天平（梅特勒-托利多）。
2 方法與结果
2.1 鹿衔草多糖的含量测定
2.1.1 供试品溶液的制备
称取鹿衔草药材约500g，置于圆底烧瓶中，加入5倍量石油醚（沸程30～60 °C），于40°C水浴回流浸提2h，过滤，残渣挥干石油醚；加10倍药材量80%乙醇于80°C水浴回流2h，过滤，残渣用10倍量80%乙醇洗涤2次，过滤，残渣挥干乙醇，置于60°C恒温干燥箱中干燥24h，备用。称取干燥后鹿衔草残渣约10g，精密称定，加水于一定温度下回流提取一定时间，过滤，滤液置于250 mL 量瓶中，用水定容，即得。
2.1.2 线性关系考察
精密称取105°C干燥至恒重的无水葡萄糖对照品30mg，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，得对照品储备液。分别精密移取该储备液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL 置于10 mL 具塞试管中，各加水至2. 0ml，摇匀，在冰水浴中缓缓滴加0. 2 % 蒽酮-硫酸溶液至刻度，混匀，放冷后置水浴中保温1 0分钟，取出，立即置冰水浴中冷却10分钟，取出，以相应试剂为空白。照紫外-可见分光光度法，在582nm波长处测定吸光度A，以A为纵坐标，对照品质量浓度为横坐标，得回归方程A= 27.429C+0.132（R2 = 0. 9974），表明葡萄糖质量浓度在3～18 mg·L-1 与A呈良好线性关系。
2.2 多糖提取率的测定
采用蒽酮-硫酸法测定。精密移取供试品溶液1.0 mL置于10 mL 具塞试管中，按2.1.2项下自“加水至2.0mL”起，依次显色，测定A，计算多糖提取率。
多糖提取率（%）=多糖质量/药材质量×100%
2.3 单因素试验考察
2.3.1加水量
精密称取2.1.1项下干燥的鹿衔草药材残渣约10g，共5份，分别加入5，10，15，20，25倍量水，于80°C水浴浸提120min，提取1次，趁热过滤，滤液置于250 mL 量瓶中，用水定容，测定A，计算多糖提取率分别为1.21%，1.46%，1.97%，2.12%，2.14%，加水量在1∶20的时候多糖提取率已经趋于饱和。
2.3.2提取时间
精密称取2.1.1 项下干燥的鹿衔草药材残渣5份，每份约10 g，分别加200mL水于80°C水浴浸提60，90，120，150，180min，提取1次，按2.3.1项下自“趁热过滤”起开始操作，结果多糖提取率分别为1.04%，1.47%，2.12%，2.43%，2.38%，可能是因为多糖经长时间加热后发生部分水解，而使其含量降低[14]，故选取浸提时间150min。
2.3.3提取温度
精密称取2.1.1项下干燥的鹿衔草药材残渣5份，每份约10 g，分别加200mL水于60，70，80，90，100°C水浴浸提150min，提取1次，按2.3.1项下自“趁热过滤”起开始操作，结果多糖提取率分别为1.36%，1.75%，2.43%，2.76%，2.82%，提取温度越高，多糖得率越高。 2.3.4提取次数
精密称取2.1.1项下干燥的鹿衔草药材残渣4份，每份约10 g，加200 mL水于100°C分别提取1，2，3，4次，每次150min，按2.3.1项下自“趁热过滤”起开始操作，结果多糖提取率分别为2.82%，3.47%，3.63%，3.69%，第2次提取完成后基本多糖提取完全。
2.4 Box-Behnken效应面法优选
在单因素试验基础上，由于提取次数为非连续变量，不能进行回归处理[15]，固定提取2次，分析因素表见表1，Box-Behnken效应面法设计方案及实验结果见表2。选取加水量、提取时间、提取温度为自变量，鹿衔草多糖提取率为因变量，每个因素设计3个水平，分别用代码-1，0，1，表示。
将表2 中数据运用Design-Expert 8.05b 软件进行响应面分析，以多糖提取率（Y）为响应值分别对各因素进行多元线性回归二项式方程拟合，拟合模型为Y=3.31+0.1X1+0.3X2+0.07X3-0.02X1X2-0.07X1X3-0.05X2X3-0.045X12-0.095X22-0.21X32（R2=0.9888；RAdj2=0.9744），对模型采用F检验进行方差分析及模型系数显著性检查，结果见表3。
由表3可知，温度对鹿衔草多糖得率影响最大（P<0.0001），其次是加水量和提取时间。二项式模型P<0.0001，达极显著水平，说明该方程与实际情况拟合良好，模型的残差可能是随机误差产生，可用此模型和方程来分析预测最佳提取工艺条件，多糖提取率与任意2个因素的三维效应面曲线见图6。以鹿衔草多糖提取率最大值为目标，根据“Design Expert 8.05b”实验设计软件得最佳鹿衔草多糖提取工艺参数为：加水量24.9倍，提取时间146.5min，提取温度100°C，提取数2次，鹿衔草多糖提取率预测最大值3.55%。
2.5 提取工艺参数验证
按照星点设计优化后的工艺参数提取3批鹿衔草多糖，多糖提取率结果见表4，平均提取率为13.74%±0.29%（n=3），验证实验值与模型预测值偏差为0.02%，可知，实验观察值和模型预测值比较接近，说明模型预测性良好。
2.6 鹿衔草多糖抗氧化研究
2.6.1 鹿衔草多糖对DPPH 自由基清除作用
按照文献[16] 的方法测定鹿衔草多糖对DPPH 自由基清除作用，配置浓度为1.0×10-4 mol/L 的DPPH 乙醇溶液，取2 mL的DPPH 乙醇溶液和2 mL鹿衔草多糖溶液，置于具塞试管中，室温30 min，以蒸馏水为空白调零于517 nm 测定其吸光度为Ai；测定2 mL 浓度为1.0×10-4 mol/L的DPPH 溶液与2 mL 蒸馏水混合液的吸光度为A0；测定2 mL 多糖样品溶液与2 mL 无水乙醇混合液的吸光度为Aj。按照下列公式计算清除率，根据不同浓度多糖溶液对DPPH 自由基的清除率作图。以Vc作为阳性对照。
DPPH 自由基抑制率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%
2.6.2鹿衔草多糖抗氧化结果
鹿衔草多糖对DPPH 自由基有较为明显的清除作用，并随着多糖浓度的增加作用增强，且浓度达到5mg/mL时清除率达到80%以上。
3 討论
结果表明，通过Box-Behnken效应面法优化得到的鹿衔草多糖提取方法稳定可行。温度和加水量对多糖提取率有极显著影响。其原因为高温会增加药物成分的运动交换，液料比的增加有利于多糖的溶解及扩散，但过高的液料比不利于后期提取溶液的浓缩。
本试验通过用Box-Behnken效应面法研究了加水量、提取时间、提取温度对鹿衔草多糖提取率相互作用的数学模型，并预测最佳提取工艺：鹿衔草加24.9倍水在100℃提取2次，每次146.5min，以此工艺条件得多糖提取率为3.57%，与预测值相符，说明了用响应面分析法来设计最佳提取工艺合理可行。
参考文献：
[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 一部. 北京：中国医药科技出版社，2015：324-324.
[2] 雒馨怡，陈晓辉，毕开顺，等. 响应面法优化鹿衔草总黄酮的酶联半仿生法提取工艺[J]. 中国实验方剂学杂志，2013，19（12）：73-74.
[3] 姚晓慧，段喜华，段明慧，等. 鹿蹄草中2"-0-没食子酰基金丝桃苷的提取工艺研究[J]. 植物研究，2012，32（4）：429-432.
[4] 王丹阳，康永祥，侯姣姣，等.陕西产2种鹿蹄草的多酚含量测定及抗氧化性研究[J].西北林学院学报，2014，29（4）：19-22.
[5] 任凤霞，杨郁，张爱军，等. 鹿蹄草中一个新的萘醌类化合物[J]. 药学学报，2010，45（8）：1025-1027.
[6] 张园园，陈晓辉，金哲史，等. 普通鹿蹄草的化学成分Ⅰ[J]. 中国实验方剂学杂志，2011，17（20）：114-117.
[7] 莫正昌，胡美忠，刘芸. 鹿蹄草多糖提取工艺研究[J]. 河南农业，2016，（8）：56-57.
[8] 董晶晶，张杰，刘炯，等. 鹿衔草多糖不同提取方法的比较[J]. 中医学报，2015，30（8）：1173-1175.
[9] 莫正昌，吴兰芳，杨娟，等. 鹿蹄草多糖LTC-Ⅱ分离纯化及结构性质研究[J]. 中国中药杂志，2011，36（12）：1633-1636.
[10] 冀晓雯，何春欢，潘英明，等. 鹿衔草不同溶剂提取物抗氧化活性研究[J]. 食品工业科技，2009，30（4）：100-102.
[11] Xiao-Hui Yao，Dong-Yang Zhang，Yuan-Gang Zu，et al. Free radical scavenging capability，antioxidant activity and chemical constituents of Pyrola incarnata Fisch. leaves[J]. Industrial Crops and Products，2013，49：247– 255.
[12] 盛华刚. 鹿衔草的化学成分与药理作用研究进展[J]. 西北药学杂志，2012，27（4）：383-385.
[13] 张囡，康廷国，尹海波. 星点设计-响应面法优化穿龙薯蓣多糖提取工艺[J].中药材，2011，34（1）：123-126.
[14] 刘荣，韦正，银玲，等. 星点设计-效应面法优化陈皮多糖提取工艺[J]. 中国实验方剂学杂志，2013，19（18）：23-26.
[15] 佟苗苗，翟延君，王添敏，等. 星点设计-响应面法优化急性子多糖提取工艺[J].中药材，2011，33（7）：1171-1174.
[16] 李琴，李纳新. 星点设计-响应面法优化超声波提取石榴皮多糖的工艺及抗氧化活性研究[J]. 新乡医学院学报，2014，34（3）：182-186.
关键词：多糖；鹿衔草；响应面法；抗氧化
鹿衔草又名鹿蹄草，鹿寿草，是鹿蹄草科（Pyrolaceae）鹿蹄草属（Pyrola）植物鹿蹄草（Pyrola calliantha H. Andres）或普通鹿蹄草（Pyrola decorate H. Andres）的干燥全草[1]。具有祛风湿，强筋骨，止血，止咳。临床上常用于风湿痹痛，肾虚腰痛，腰膝无力，月经过多，久咳劳嗽。现代药理研究表明鹿衔草含黄酮类[2-3]、酚苷类[4]、醌类[5]、萜类[6]、多糖[7-9]等化学成分，具有抗菌、抗炎、对心血管系统作用、抗氧化[10-11]、抗肿瘤等多种药理作用[12]。目前关于鹿衔草黄酮和多酚的抗氧化研究报道较多，随着对多糖类成分抗氧化的研究日益增多，也有部分关于多糖提取的研究报道，但对鹿衔草抗氧化的研究还比较少，因而研究其提取工艺和抗氧化活性更加重要。
星点设计（central composite design，CCD）是常用的一种由于提取工艺优化的设计方法，在中药提取工艺研究中广泛使用[13]。之前已有应用正交设计研究水提取、碱水提取和酶法提取结合醇沉法制备鹿衔草多糖的工艺研究[7-8]，因此我们选用水作为提取溶剂，在单因素实验基础上，采用星点设计法安排提取实验，结合响应面法优化鹿衔草多糖提取工艺并对其抗氧化活性进行研究，以期为鹿衔草的开发应用提供依据和参考。
1 材料与仪器
鹿衔草药材（购于陕西太白县）。D-无水葡萄糖对照品（中国食品药品检定研究所），浓硫酸、苯酚、乙醇等均为分析纯；实验用水为纯化水。
Autoscience AS 5150A超声波清洗器（天津奥特赛恩斯仪器有限公司），电热式恒温水浴锅（江苏金坛宏凯仪器厂），RE-52AA旋转蒸发器（上海亚荣生化仪器厂），TU-1901双光束紫外可见分光光度计（北京普析通用仪器有限责任公司），LXJ-Ⅱ离心沉淀机（上海医用分析仪器厂），ME104电子天平（梅特勒-托利多）。
2 方法與结果
2.1 鹿衔草多糖的含量测定
2.1.1 供试品溶液的制备
称取鹿衔草药材约500g，置于圆底烧瓶中，加入5倍量石油醚（沸程30～60 °C），于40°C水浴回流浸提2h，过滤，残渣挥干石油醚；加10倍药材量80%乙醇于80°C水浴回流2h，过滤，残渣用10倍量80%乙醇洗涤2次，过滤，残渣挥干乙醇，置于60°C恒温干燥箱中干燥24h，备用。称取干燥后鹿衔草残渣约10g，精密称定，加水于一定温度下回流提取一定时间，过滤，滤液置于250 mL 量瓶中，用水定容，即得。
2.1.2 线性关系考察
精密称取105°C干燥至恒重的无水葡萄糖对照品30mg，置于100 mL容量瓶中，加水溶解并稀释至刻度，得对照品储备液。分别精密移取该储备液0，0.1，0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mL 置于10 mL 具塞试管中，各加水至2. 0ml，摇匀，在冰水浴中缓缓滴加0. 2 % 蒽酮-硫酸溶液至刻度，混匀，放冷后置水浴中保温1 0分钟，取出，立即置冰水浴中冷却10分钟，取出，以相应试剂为空白。照紫外-可见分光光度法，在582nm波长处测定吸光度A，以A为纵坐标，对照品质量浓度为横坐标，得回归方程A= 27.429C+0.132（R2 = 0. 9974），表明葡萄糖质量浓度在3～18 mg·L-1 与A呈良好线性关系。
2.2 多糖提取率的测定
采用蒽酮-硫酸法测定。精密移取供试品溶液1.0 mL置于10 mL 具塞试管中，按2.1.2项下自“加水至2.0mL”起，依次显色，测定A，计算多糖提取率。
多糖提取率（%）=多糖质量/药材质量×100%
2.3 单因素试验考察
2.3.1加水量
精密称取2.1.1项下干燥的鹿衔草药材残渣约10g，共5份，分别加入5，10，15，20，25倍量水，于80°C水浴浸提120min，提取1次，趁热过滤，滤液置于250 mL 量瓶中，用水定容，测定A，计算多糖提取率分别为1.21%，1.46%，1.97%，2.12%，2.14%，加水量在1∶20的时候多糖提取率已经趋于饱和。
2.3.2提取时间
精密称取2.1.1 项下干燥的鹿衔草药材残渣5份，每份约10 g，分别加200mL水于80°C水浴浸提60，90，120，150，180min，提取1次，按2.3.1项下自“趁热过滤”起开始操作，结果多糖提取率分别为1.04%，1.47%，2.12%，2.43%，2.38%，可能是因为多糖经长时间加热后发生部分水解，而使其含量降低[14]，故选取浸提时间150min。
2.3.3提取温度
精密称取2.1.1项下干燥的鹿衔草药材残渣5份，每份约10 g，分别加200mL水于60，70，80，90，100°C水浴浸提150min，提取1次，按2.3.1项下自“趁热过滤”起开始操作，结果多糖提取率分别为1.36%，1.75%，2.43%，2.76%，2.82%，提取温度越高，多糖得率越高。 2.3.4提取次数
精密称取2.1.1项下干燥的鹿衔草药材残渣4份，每份约10 g，加200 mL水于100°C分别提取1，2，3，4次，每次150min，按2.3.1项下自“趁热过滤”起开始操作，结果多糖提取率分别为2.82%，3.47%，3.63%，3.69%，第2次提取完成后基本多糖提取完全。
2.4 Box-Behnken效应面法优选
在单因素试验基础上，由于提取次数为非连续变量，不能进行回归处理[15]，固定提取2次，分析因素表见表1，Box-Behnken效应面法设计方案及实验结果见表2。选取加水量、提取时间、提取温度为自变量，鹿衔草多糖提取率为因变量，每个因素设计3个水平，分别用代码-1，0，1，表示。
将表2 中数据运用Design-Expert 8.05b 软件进行响应面分析，以多糖提取率（Y）为响应值分别对各因素进行多元线性回归二项式方程拟合，拟合模型为Y=3.31+0.1X1+0.3X2+0.07X3-0.02X1X2-0.07X1X3-0.05X2X3-0.045X12-0.095X22-0.21X32（R2=0.9888；RAdj2=0.9744），对模型采用F检验进行方差分析及模型系数显著性检查，结果见表3。
由表3可知，温度对鹿衔草多糖得率影响最大（P<0.0001），其次是加水量和提取时间。二项式模型P<0.0001，达极显著水平，说明该方程与实际情况拟合良好，模型的残差可能是随机误差产生，可用此模型和方程来分析预测最佳提取工艺条件，多糖提取率与任意2个因素的三维效应面曲线见图6。以鹿衔草多糖提取率最大值为目标，根据“Design Expert 8.05b”实验设计软件得最佳鹿衔草多糖提取工艺参数为：加水量24.9倍，提取时间146.5min，提取温度100°C，提取数2次，鹿衔草多糖提取率预测最大值3.55%。
2.5 提取工艺参数验证
按照星点设计优化后的工艺参数提取3批鹿衔草多糖，多糖提取率结果见表4，平均提取率为13.74%±0.29%（n=3），验证实验值与模型预测值偏差为0.02%，可知，实验观察值和模型预测值比较接近，说明模型预测性良好。
2.6 鹿衔草多糖抗氧化研究
2.6.1 鹿衔草多糖对DPPH 自由基清除作用
按照文献[16] 的方法测定鹿衔草多糖对DPPH 自由基清除作用，配置浓度为1.0×10-4 mol/L 的DPPH 乙醇溶液，取2 mL的DPPH 乙醇溶液和2 mL鹿衔草多糖溶液，置于具塞试管中，室温30 min，以蒸馏水为空白调零于517 nm 测定其吸光度为Ai；测定2 mL 浓度为1.0×10-4 mol/L的DPPH 溶液与2 mL 蒸馏水混合液的吸光度为A0；测定2 mL 多糖样品溶液与2 mL 无水乙醇混合液的吸光度为Aj。按照下列公式计算清除率，根据不同浓度多糖溶液对DPPH 自由基的清除率作图。以Vc作为阳性对照。
DPPH 自由基抑制率=[1-（Ai-Aj）/A0]×100%
2.6.2鹿衔草多糖抗氧化结果
鹿衔草多糖对DPPH 自由基有较为明显的清除作用，并随着多糖浓度的增加作用增强，且浓度达到5mg/mL时清除率达到80%以上。
3 討论
结果表明，通过Box-Behnken效应面法优化得到的鹿衔草多糖提取方法稳定可行。温度和加水量对多糖提取率有极显著影响。其原因为高温会增加药物成分的运动交换，液料比的增加有利于多糖的溶解及扩散，但过高的液料比不利于后期提取溶液的浓缩。
本试验通过用Box-Behnken效应面法研究了加水量、提取时间、提取温度对鹿衔草多糖提取率相互作用的数学模型，并预测最佳提取工艺：鹿衔草加24.9倍水在100℃提取2次，每次146.5min，以此工艺条件得多糖提取率为3.57%，与预测值相符，说明了用响应面分析法来设计最佳提取工艺合理可行。
参考文献：
[1] 国家药典委员会. 中华人民共和国药典[M]. 一部. 北京：中国医药科技出版社，2015：324-324.
[2] 雒馨怡，陈晓辉，毕开顺，等. 响应面法优化鹿衔草总黄酮的酶联半仿生法提取工艺[J]. 中国实验方剂学杂志，2013，19（12）：73-74.
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[6] 张园园，陈晓辉，金哲史，等. 普通鹿蹄草的化学成分Ⅰ[J]. 中国实验方剂学杂志，2011，17（20）：114-117.
[7] 莫正昌，胡美忠，刘芸. 鹿蹄草多糖提取工艺研究[J]. 河南农业，2016，（8）：56-57.
[8] 董晶晶，张杰，刘炯，等. 鹿衔草多糖不同提取方法的比较[J]. 中医学报，2015，30（8）：1173-1175.
[9] 莫正昌，吴兰芳，杨娟，等. 鹿蹄草多糖LTC-Ⅱ分离纯化及结构性质研究[J]. 中国中药杂志，2011，36（12）：1633-1636.
[10] 冀晓雯，何春欢，潘英明，等. 鹿衔草不同溶剂提取物抗氧化活性研究[J]. 食品工业科技，2009，30（4）：100-102.
[11] Xiao-Hui Yao，Dong-Yang Zhang，Yuan-Gang Zu，et al. Free radical scavenging capability，antioxidant activity and chemical constituents of Pyrola incarnata Fisch. leaves[J]. Industrial Crops and Products，2013，49：247– 255.
[12] 盛华刚. 鹿衔草的化学成分与药理作用研究进展[J]. 西北药学杂志，2012，27（4）：383-385.
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[14] 刘荣，韦正，银玲，等. 星点设计-效应面法优化陈皮多糖提取工艺[J]. 中国实验方剂学杂志，2013，19（18）：23-26.
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[16] 李琴，李纳新. 星点设计-响应面法优化超声波提取石榴皮多糖的工艺及抗氧化活性研究[J]. 新乡医学院学报，2014，34（3）：182-186.