【摘 要】
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[目的]采用Cre-LoxP同源重组系统构建并鉴定携带人胰岛素样生长因子-1(human insulin-likegrowth factor-1,hIGF-1)目的基因的复制缺陷重组腺病毒,为椎间盘退变的hIGF-1基因
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[目的]采用Cre-LoxP同源重组系统构建并鉴定携带人胰岛素样生长因子-1(human insulin-likegrowth factor-1,hIGF-1)目的基因的复制缺陷重组腺病毒,为椎间盘退变的hIGF-1基因治疗奠定基础。[方法]PCR合成hIGF-1基因,用pMD18-T载体克隆hIGF-1目的基因,酶切、测序并进行NCBI BLAST相似性在线分析。将pMD18-T-hIGF-1和pDNR-1r质粒分别行EcoR Ⅰ和BamH Ⅰ双酶切,DNA连接酶连接双酶切产物,转化感受态大肠杆菌DH5α,合成中间载体pDNR-hIGF-1,酶切鉴定。Cre-loxP系统介导pDNR-hIGF-1和pInt.AV1.SpaT同源重组形成pInt.AV1.SpaT-hIGF-1重组表达质粒,行EcoR Ⅰ酶切鉴定。复苏293细胞,将pInt.AV1.SpaT-hIGF-1和pInt.B.B质粒在293细胞内进行同源重组成含hIGF-1基因的复制缺陷重组腺病毒。倒置显微镜观察293细胞病变样效(cytopathogenic effect,CPE);透射电镜观察293细胞中的病毒颗粒;提取细胞裂解液中病毒DNA,PCR鉴定hIGF-1目的基因的存在;Western blot检测hIGF-1蛋白表达。用半数组织培养感染量(tissue culture infectious dose 50,TCID50)方法测定重组腺病毒的滴度。[结果]克隆的hIGF-1目的基因经NCBI BLAST相似性在线分析证实与Homo sapiens IGF-1(GI:19923111)完全相同。pInt.AV1.SpaT-hIGF-1酶切鉴定,出现5.4 kb
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