论文部分内容阅读
目的 探究青蒿琥酯对人大肠癌CCL229细胞恶性生物学行为抑制作用的机制.方法 采用MTT法检测青蒿琥酯对CCL229细胞活力的影响;通过流式细胞术检测青蒿琥酯对CCL229细胞凋亡的影响;采用Transwell法检测青蒿琥酯对CCL229细胞侵袭能力的影响;采用克隆形成实验检测青蒿琥酯对CCL229细胞集落形成能力的影响;采用Western blotting法检测青蒿琥酯对CCL229细胞内自噬特异性蛋白如自噬效应蛋白(Beclin1)、轻链3-Ⅰ/Ⅱ蛋白(light chain 3-Ⅰ/Ⅱ,LC3-Ⅰ/Ⅱ)、自噬相关蛋白5(autophagy related protein 5,Atg5)、Atg5-Atg12复合物以及上皮间质转化(epithelial-mesenchymal transition,EMT)相关蛋白如紧密连接蛋白(ZO-1)、上皮钙黏蛋白(epithelial cadherin,E-cadherin)、神经钙黏蛋白(neuronal cadherin,N-cadherin)、锌指转录因子(Slug)和第10号染色体同源缺失性磷酸酶-张力蛋白(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)表达的影响;采用qRT-PCR法检测青蒿琥酯对CCL229细胞内miR-21 mRNA表达的影响;通过双荧光素酶报告基因实验验证miR-21与PTEN的靶向关系;考察过表达或抑制miR-21与PTEN对青蒿琥酯抑制CCL229细胞恶行生物学行为的影响.结果 青蒿琥酯显著降低CCL229细胞存活率(P＜0.05、0.01、0.001),显著促进CCL229细胞凋亡(P＜0.001),显著抑制CCL229细胞侵袭和克隆形成能力(P＜0.001),显著上调CCL229细胞内Atg5-Atg12复合物、Atg5、Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ、ZO-1、E-cadherin表达水平(P＜0.05、0.01),显著下调N-cadherin和Slug蛋白表达水平(P＜0.05).CCL229细胞内miR-21 mRNA高表达(P＜0.01),青蒿琥酯显著抑制CCL229细胞内miR-21 mRNA表达水平(P＜0.05).过表达miR-21显著抑制青蒿琥酯对CCL229细胞的促凋亡作用(P＜0.001),显著减弱青蒿琥酯对CCL229细胞侵袭和克隆形成能力的抑制作用(P＜0.01),显著抑制青蒿琥酯对CCL229细胞Atg5-Atg 12复合物、Atg5、Beclin1、LC3-Ⅰ/Ⅱ、ZO-1、E-cadherin表达水平的上调作用(P＜0.05、0.01),显著抑制青蒿琥酯对CCL229细胞N-cadherin和Slug蛋白表达水平的下调作用(P＜0.01);抑制miR-21则作用相反.PTEN是miR-21的下游靶基因,过表达miR-21显著抑制CCL229细胞内PTEN蛋白表达水平(P＜0.01),抑制miR-21显著上调PTEN蛋白表达水平(P＜0.01),过表达miR-21显著抑制野生型PTEN(WT-PTEN)质粒的荧光素酶活性(P＜0.01).过表达PTEN与抑制miR-21表达对CCL229细胞作用一致,同时过表达miR-21和PTEN不会影响青蒿琥酯对CCL229细胞恶性生物学行为的抑制作用.结论 青蒿琥酯能够通过调控miR-21和PTEN表达诱导CCL229细胞凋亡和自噬,并抑制细胞增殖和侵袭.