【摘 要】
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目的建立一套系统、完整的粪便日本血吸虫虫卵DNA提取法及PCR优化体系。方法利用蛋白酶K和苯酚法从感染日本血吸虫尾蚴的家兔粪便中提取DNA,根据日本血吸虫基因(AF00369)设计
【机 构】
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皖南医学院寄生虫学教研室; 安徽省血吸虫病防治研究所;
【基金项目】
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安徽省国际科技合作项目(06088017)
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目的建立一套系统、完整的粪便日本血吸虫虫卵DNA提取法及PCR优化体系。方法利用蛋白酶K和苯酚法从感染日本血吸虫尾蚴的家兔粪便中提取DNA,根据日本血吸虫基因(AF00369)设计特异性引物,以粪便中提取的DNA为模板,采用PCR方法扩增目的基因片段,对PCR方法的各种反应条件进行优化并采用有限稀释法推测PCR检测法可检测到的最低虫卵数。结果以感染家兔的粪便中提取的DNA为模板,用PCR方法可扩增到分子量大小约为400 bp的特异性条带,测序结果经BLAST工具进行分析,与日本血吸虫基因(AF00369)比对的同源性为96%;25μl PCR反应体系的最优化反应条件:MgCl2 1.5μl;dNTP 0.5μl;引物1.0μl;DNA模板5.0μl;Taq DNA聚合酶0.5μl。扩增程序为:94℃预变性5min、94℃变性30s、53℃退火30s、72℃延伸30s,30个循环、72℃延伸7min、4℃保存。PCR检测法可检测到的最低虫卵数为0.015个。结论成功建立感染家兔粪便中虫卵DNA的提取方法及PCR血吸虫基因片段检测方法,同时对PCR反应条件进行优化,为从分子角度检测日本血吸虫虫卵DNA提供科学的实验依据。
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