论文部分内容阅读
摘 要：酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）试验目前成为兽医实验室最重要、使用最频繁、最广泛的血清学检测方法。操作过程中涉及环节和细节相对较多，若掌握得不太熟练或不理解实验原理，将直接影响检测结果的准确性。本文主要从样本、试剂、加样、温育、洗板、显色和酶标仪等方面分别进行了阐述和分析，对科学全面系统掌握本检测方法、提高检测结果的准确性和提升基层实验室检测能力具有一定的指导意义。
关键词：ELISA；样本；温育；显色；质量控制
中图分类号：S855.3 文献标志码：C 文章编号：1001-0769（2017）07-0092-03
酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）具有灵敏度高、特异性强、重复性好、自动化程度高和安全等优点，已成为动物疫病预防控制系统各级兽医实验室使用最频繁、最广泛、最重要的血清学检测方法，在动物疫病诊断检测工作中发挥着举足轻重的作用。然而，从各实验室检测和人员技术掌握情况看，对ELISA特别是口蹄疫液相阻断ELISA检测操作过程中各环节的操作细节掌握和重视不够，发生显色不全、显色过深、跳孔、非特异性显色和花板等现象仍然较为频繁，使检测结果受到较大影响。之所以发生上述现象，最主要的原因是各种操作失误所致，包括没有掌握相关知识和不按要求操作两类。另有极少部分是由于水质量不达标引起的，除此之外还有少量失败案例是由于设备使用不当或透光不良引起的。笔者将操作中各环节出现的最为普遍的问题和对策总结如下，供大家参考。
1 样本采集或处理不当造成的假阳性和假阴性及对策
首先，样本避免溶血，溶血样本会释放出具有过氧化物酶活性的物质，此物质的存在可能以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定非特异性显色增加，结果呈假阳性。对策是溶血样本作为不合格样本不予检测。
其次，样本避免被细菌污染，因为菌体中含有的内源性辣根过氧化物酶可能会造成假阳性反应。对策是怀疑被污染样本作为不合格样本不予检测。
最后，样本冻融后，蛋白质分布不均，吸取样本时若未吸到抗体蛋白可能会形成假阴性反应。对策是对冻融样本采取轻缓上下颠倒混匀，切忌在混匀器上强烈振荡。
2 试剂使用方面存在的问题和对策
第一，试剂从冰箱拿出来立即使用，试剂温度未恢复到室温，抗原抗体作用的温度达不到反应需要的温度需求。对策是把冷藏试剂从冰箱拿出后平衡至室温方可使用（密封的反应板在平衡时应根据需要拆开包装）。
第二，试剂盒使用后未及时放回冰箱。对策是试剂盒使用后应及时放回冰箱。
第三，发现浓缩洗液有结晶析出而不做处理。对策为采用温箱或水浴加热的办法，使结晶物完全溶解后再稀释使用。
3 加样环节存在的问题和对策
第一，移液器加样时，吸取不同试剂瓶液体时未换枪头。对策为吸取不同的液体应及时更换枪头。
第二，移液器吸取液体时速度太快而产生气泡，使吸取的液体量不足。对策为放慢吸取液体的速度。
第三，向酶标孔中加液体时，枪头插入太深而接触到孔内液体，造成污染，或由于枪头的毛细作用使部分液体不能流出而造成误差。对策为打完液体后及时更换枪头。
第四，酶标板加完液体后晃动不均匀，造成作用不充分和显色不全。对策为每加完一次液体应将酶标板放在桌子上平行轻轻摇晃30 s，使液体充分混匀，保证作用充分和显色全面。
4 温育环节存在的问题和对策
第一，酶标板在温育前忘记用封板膜密封，温育过程中反应体系缓慢蒸发，使抗原抗体吸附于孔壁，难于清洗彻底，造成显色过深。对策为温育前用封板膜密封反应板。
第二，温育时温箱温度或室温达不到要求，造成显色不全成假阴性。对策为开始试验前开启并设定温箱温度，在温育前用温度计进行测定；室温温育时，在实验前开启空调，使室温达到温育所需温度。
第三，温育时酶标板叠放在温箱，叠放过多造成中间的酶标板板温育温度不够，而使温育不彻底，造成显色不全而出现假阴性；还可能使ELISA的边缘效应加剧。对策为酶标板最好不要叠放，若叠放建议不要超过3块。
5 洗板过程存在的问题和对策
第一，手工洗板时孔与孔之间液体交叉，造成相互污染，使阴性样本变为阳。对策为洗板时孔内加液不要过多，防止液体溢出，向孔内打液体时，尽量避免因用力过猛而产生气泡。
第二，洗板机洗板时洗液瓶洗液太少，造成洗板不能完成。对策为洗板前给洗液瓶加满洗液并随时检查洗液瓶洗液液位。
第三，洗板机洗板针吸液不畅或堵塞，因抽吸不完全造成洗板不彻底。对策为洗板前检查洗板机，保证每个针孔通畅。
第四，用洗板机洗板时未调整好微孔液体残余量，余量超过2 μL易导致洗板不干净和产生假阳性结果，造成洗板不彻底。对策为调整洗板机吸液量和打出液体量，发现针头堵塞要及时疏通。
第五，交叉使用不同项目的洗涤液造成洗板不彻底或洗脱。对策为采用专用的洗板液洗板。
第六，每批反应板过多，反应板过多会造成洗板等待时间延长，使洗板不彻底。对策为每次实验时不要做过多的板，每批最好控制在20个板以内。
6 显色过程存在的问题和对策
第一，显色剂配制过早或使用过期的显色剂，这样均会造成显色不全。对策为最后一次洗板时配制显色剂，不使用过期显色剂。
第二，有A、B两种液体为显色底物的，由于两种液体不稳定，使用保存不当会产生颜色而对结果产生影响。对策为使用时发现有颜色必须启用新的底物，加显色液时应先加A液后加B液。显色时间严格执行说明书规定。
第三，加显色剂時液体溅出孔外形成液体回流，造成跳孔。对策为加显色液时尽量避免液体溅出孔外形成液体回流。
第四，反应板较多时，尽量争取同一时间显色。时间对显色很重要，反应板较多时，加样、洗板和温育等操作都延长，均会使结果偏差加大。对策为具体操作时，应尽量争取同一时间显色，加样的时间越统一，结果误差越小。
7 酶标仪
第一，环境潮湿的实验室，酶标仪长期放置后滤光片可能会发生霉变。对策为使用前应检查滤光片，发现滤光片霉变时可用擦镜纸小心擦拭，并核对滤光值。
第二，加入终止液后直接测OD值，可能会造成显色不均匀和跳孔。对策为加入终止液后，反应板进仓后设置测量前震荡混匀3 s以上后开始检测，以保证显色均匀和防止跳孔。
8 质量控制
实验室质量控制体系的成功运行对检验结果的准确性有直接影响。做好室内质量控制对ELISA试验来说非常重要，而室内质量控制主要是借助室内质量控制血清来进行的。因此，有条件的实验室，应自己制备室内质量控制血清。每次检测时与普通样本同时进行。质量控制血清的低值（弱阳性-临界值）监测是检测精密度观察的最敏感窗口。同时也是提示试验成功与否的最重要标志。但要注意的是不能把弱阳性-临界值质控物作为判断结果的准质量控制血清，同时要避免对其反复冻融而造成质量控制血清变性。
9 结语
总之，在ELISA检测具体操作过程中，应注意避免对溶血样本进行检测，必须保证试剂平衡至室温，选择量程与吸取样本量接近的移液器加样，严格控制温育所需的温箱温度（或室温），严格按照检验操作规程或说明书操作。同时要掌握ELISA原理，清楚每项操作步骤的目的和意义，注重操作细节，反复练习，做到熟能生巧，才能把ELISA试验做好、做准确、做精。同时要按照实验室管理体系文件中的表格文件做好检测结果的记录，保证记录内容真实、信息全面、格式规范。
关键词：ELISA；样本；温育；显色；质量控制
中图分类号：S855.3 文献标志码：C 文章编号：1001-0769（2017）07-0092-03
酶联免疫吸附测定（Enzyme-linked Immuno Sorbent Assay，ELISA）具有灵敏度高、特异性强、重复性好、自动化程度高和安全等优点，已成为动物疫病预防控制系统各级兽医实验室使用最频繁、最广泛、最重要的血清学检测方法，在动物疫病诊断检测工作中发挥着举足轻重的作用。然而，从各实验室检测和人员技术掌握情况看，对ELISA特别是口蹄疫液相阻断ELISA检测操作过程中各环节的操作细节掌握和重视不够，发生显色不全、显色过深、跳孔、非特异性显色和花板等现象仍然较为频繁，使检测结果受到较大影响。之所以发生上述现象，最主要的原因是各种操作失误所致，包括没有掌握相关知识和不按要求操作两类。另有极少部分是由于水质量不达标引起的，除此之外还有少量失败案例是由于设备使用不当或透光不良引起的。笔者将操作中各环节出现的最为普遍的问题和对策总结如下，供大家参考。
1 样本采集或处理不当造成的假阳性和假阴性及对策
首先，样本避免溶血，溶血样本会释放出具有过氧化物酶活性的物质，此物质的存在可能以辣根过氧化物酶为标记的ELISA测定非特异性显色增加，结果呈假阳性。对策是溶血样本作为不合格样本不予检测。
其次，样本避免被细菌污染，因为菌体中含有的内源性辣根过氧化物酶可能会造成假阳性反应。对策是怀疑被污染样本作为不合格样本不予检测。
最后，样本冻融后，蛋白质分布不均，吸取样本时若未吸到抗体蛋白可能会形成假阴性反应。对策是对冻融样本采取轻缓上下颠倒混匀，切忌在混匀器上强烈振荡。
2 试剂使用方面存在的问题和对策
第一，试剂从冰箱拿出来立即使用，试剂温度未恢复到室温，抗原抗体作用的温度达不到反应需要的温度需求。对策是把冷藏试剂从冰箱拿出后平衡至室温方可使用（密封的反应板在平衡时应根据需要拆开包装）。
第二，试剂盒使用后未及时放回冰箱。对策是试剂盒使用后应及时放回冰箱。
第三，发现浓缩洗液有结晶析出而不做处理。对策为采用温箱或水浴加热的办法，使结晶物完全溶解后再稀释使用。
3 加样环节存在的问题和对策
第一，移液器加样时，吸取不同试剂瓶液体时未换枪头。对策为吸取不同的液体应及时更换枪头。
第二，移液器吸取液体时速度太快而产生气泡，使吸取的液体量不足。对策为放慢吸取液体的速度。
第三，向酶标孔中加液体时，枪头插入太深而接触到孔内液体，造成污染，或由于枪头的毛细作用使部分液体不能流出而造成误差。对策为打完液体后及时更换枪头。
第四，酶标板加完液体后晃动不均匀，造成作用不充分和显色不全。对策为每加完一次液体应将酶标板放在桌子上平行轻轻摇晃30 s，使液体充分混匀，保证作用充分和显色全面。
4 温育环节存在的问题和对策
第一，酶标板在温育前忘记用封板膜密封，温育过程中反应体系缓慢蒸发，使抗原抗体吸附于孔壁，难于清洗彻底，造成显色过深。对策为温育前用封板膜密封反应板。
第二，温育时温箱温度或室温达不到要求，造成显色不全成假阴性。对策为开始试验前开启并设定温箱温度，在温育前用温度计进行测定；室温温育时，在实验前开启空调，使室温达到温育所需温度。
第三，温育时酶标板叠放在温箱，叠放过多造成中间的酶标板板温育温度不够，而使温育不彻底，造成显色不全而出现假阴性；还可能使ELISA的边缘效应加剧。对策为酶标板最好不要叠放，若叠放建议不要超过3块。
5 洗板过程存在的问题和对策
第一，手工洗板时孔与孔之间液体交叉，造成相互污染，使阴性样本变为阳。对策为洗板时孔内加液不要过多，防止液体溢出，向孔内打液体时，尽量避免因用力过猛而产生气泡。
第二，洗板机洗板时洗液瓶洗液太少，造成洗板不能完成。对策为洗板前给洗液瓶加满洗液并随时检查洗液瓶洗液液位。
第三，洗板机洗板针吸液不畅或堵塞，因抽吸不完全造成洗板不彻底。对策为洗板前检查洗板机，保证每个针孔通畅。
第四，用洗板机洗板时未调整好微孔液体残余量，余量超过2 μL易导致洗板不干净和产生假阳性结果，造成洗板不彻底。对策为调整洗板机吸液量和打出液体量，发现针头堵塞要及时疏通。
第五，交叉使用不同项目的洗涤液造成洗板不彻底或洗脱。对策为采用专用的洗板液洗板。
第六，每批反应板过多，反应板过多会造成洗板等待时间延长，使洗板不彻底。对策为每次实验时不要做过多的板，每批最好控制在20个板以内。
6 显色过程存在的问题和对策
第一，显色剂配制过早或使用过期的显色剂，这样均会造成显色不全。对策为最后一次洗板时配制显色剂，不使用过期显色剂。
第二，有A、B两种液体为显色底物的，由于两种液体不稳定，使用保存不当会产生颜色而对结果产生影响。对策为使用时发现有颜色必须启用新的底物，加显色液时应先加A液后加B液。显色时间严格执行说明书规定。
第三，加显色剂時液体溅出孔外形成液体回流，造成跳孔。对策为加显色液时尽量避免液体溅出孔外形成液体回流。
第四，反应板较多时，尽量争取同一时间显色。时间对显色很重要，反应板较多时，加样、洗板和温育等操作都延长，均会使结果偏差加大。对策为具体操作时，应尽量争取同一时间显色，加样的时间越统一，结果误差越小。
7 酶标仪
第一，环境潮湿的实验室，酶标仪长期放置后滤光片可能会发生霉变。对策为使用前应检查滤光片，发现滤光片霉变时可用擦镜纸小心擦拭，并核对滤光值。
第二，加入终止液后直接测OD值，可能会造成显色不均匀和跳孔。对策为加入终止液后，反应板进仓后设置测量前震荡混匀3 s以上后开始检测，以保证显色均匀和防止跳孔。
8 质量控制
实验室质量控制体系的成功运行对检验结果的准确性有直接影响。做好室内质量控制对ELISA试验来说非常重要，而室内质量控制主要是借助室内质量控制血清来进行的。因此，有条件的实验室，应自己制备室内质量控制血清。每次检测时与普通样本同时进行。质量控制血清的低值（弱阳性-临界值）监测是检测精密度观察的最敏感窗口。同时也是提示试验成功与否的最重要标志。但要注意的是不能把弱阳性-临界值质控物作为判断结果的准质量控制血清，同时要避免对其反复冻融而造成质量控制血清变性。
9 结语
总之，在ELISA检测具体操作过程中，应注意避免对溶血样本进行检测，必须保证试剂平衡至室温，选择量程与吸取样本量接近的移液器加样，严格控制温育所需的温箱温度（或室温），严格按照检验操作规程或说明书操作。同时要掌握ELISA原理，清楚每项操作步骤的目的和意义，注重操作细节，反复练习，做到熟能生巧，才能把ELISA试验做好、做准确、做精。同时要按照实验室管理体系文件中的表格文件做好检测结果的记录，保证记录内容真实、信息全面、格式规范。