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摘要 [目的]从成熟油菜种子中抽提出高质量的RNA。[方法]该研究通过将天根植物总RNA提取试剂盒与康为世纪植物总RNA提取试剂盒相结合，使用β-巯基乙醇抑制酚类物质氧化，DNA酶去除DNA，并采用吸附柱有效去除多糖类物质等措施，对油菜种子RNA的提取方法进行有效改进。[结果]采用该方法能提取出质量高且完整性好的RNA，可一次满足后续分子生物学研究的要求。[结论]该研究提出了一种高效快捷的成熟油菜种子RNA提取方法。
关键词 油菜；成熟种子；RNA提取
中图分类号 S565.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）13-0143-02
Improvement of RNA Extraction Method from Mature Rapeseeds
GU Si-kai1，2，CHEN Gui-min2，ZHAO Wen-jun2，JI Li-lian1，2* et al
（1.College of Food Science and Engineering， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225127；
2.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Ragional Modern Agriculture and Enverinment Protection， Jiangsu Key Laboratory for Eco-agricultural Biotechnology around Hongze Lake， School of Life Science， Huaiyin Normal University， Huai’an， Jiangsu 223300）
Abstract [Objective]To extract high quality RNA from mature rapeseeds.[Method]To improve the RNA extraction method of mature rapeseeds by using two RNA extraction kits， which include RNA plant plus reagent from TIANGEN and CW2598M from KANGWEI， meanwhile， adding β-mercaptoethanol to inhibit the oxidation of phenolic compounds and removing DNA by DNase， using the adsorption column to remove polysaccharides etc. [Result]This method can get RNA with high quality， which can satisfy the requirements of subsequent molecular biology research.[Conclusion]The study provides an efficient method for extracting RNA from mature rapeseeds.
Key words Rape；Mature seeds；RNA extraction
RNA提取技術不仅是分子生物学的重要组成部分，而且是功能基因组学的基础[1]，提取高纯度、高完整度的植物组织RNA是进行基因克隆、RNA序列分析、狭线杂交以及构建cDNA文库研究的前提[2-3]。因此，如何快速高效地获得高质量的RNA成为科研人员关注的问题。
油菜是世界四大油料作物之一，成熟油菜种子中含有大量的脂肪、蛋白质、色素、单宁、多酚等物质，丰富的多酚类物质在RNA提取过程中易形成沉淀并发生褐化反应，同时抑制酶的活性等[4-5]。目前已经报道的RNA提取方法主要包括Trizol法[6]、皂土法[7]、Licl-尿素法[8]、改进SDS法[9]及CTAB法[10]等，这些方法都具有一定的局限性，特别对于次级代谢产物丰富、油脂及蛋白含量较高的材料，在总RNA提取过程中往往存在褐化、降解、低纯度等现象[4，11-12]。针对目前油菜种子RNA提取存在的问题，该研究在前期工作的基础上[2]通过多次试验探索，提出了一种高效快捷的油菜种子RNA提取方法。
1 材料与方法
1.1 材料
供试油菜（甘蓝型）播种于淮阴师范学院科技园，待油菜成熟晾晒后，剥出籽粒备用。
试验操作中所需的离心管、枪头、玻璃瓶、量筒、研钵、研杵、药匙等经高温高压灭菌后用0.1%DEPC室温浸泡处理24 h，再高温高压灭菌2次备用。电泳槽、制胶板、梳子等用3%过氧化氢溶液浸泡24 h，使用前分别用10%和0.1%的RNA酶固相清除剂先后处理5 min，最后用高压灭菌的01%DEPC水清洗3次用于制胶。
RNA plant plus reagent植物总RNA提取试剂盒DP437-02（简称天根试剂盒）购自北京天根生化科技公司；β-巯基乙醇、50×TAE Buffer、RNase-Free ddH2O均购自上海捷瑞生物工程有限公司；康为世纪全能型植物RNA提取试剂盒CW2598M（简称康为世纪试剂盒）、DNaseⅠ、固相清除剂、Gold View、DEPC水均购自康为世纪生物科技有限公司。
1.2 油菜种子总RNA提取方法
1.2.1 试剂盒提取RNA法。
采用的试剂盒分别为天根生化科技公司生产的植物总RNA提取试剂盒RNA plant plus reagent和康为世纪生物科技有限公司生产的全能型植物总RNA提取试剂盒CW2598M，操作方法分别按照各公司的说明书进行。 1.2.2 基于2种试剂盒改良法。
将天根试剂盒和康为世纪试剂盒相结合，并对试验步骤进行优化，具体步骤如下：
①取0.1 g成熟油菜种子放入已经使用液氮预冷的研钵中，并迅速研磨成粉末状；
②在低温状态下将粉末转入至2 mL的离心管中，并迅速加入800 μL含有β-巯基乙醇的RNA plant plus reagent提取液，涡旋振荡至彻底混匀，离心管平放静置5 min；
③将离心管置于已预冷的4 ℃离心机中，12 000 r/min离心2 min；
④上清转移至新的RNase-Free的2 mL离心管中，缓慢加入1/2体积的无水乙醇，颠倒数次至彻底混匀，将混合液和沉淀一起转入康为世纪试剂盒自带的吸附柱RM（Spin Columns RM with Collection Tubes）中；
⑤向吸附柱内加入80 μL康为世纪试剂盒自带的DNase Ⅰ 工作液，室温下反应5 min；
⑥向吸附柱内加入康为世纪试剂盒自带的Buffer RW1 350 μL，4 ℃12 000 r/min离心1 min，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；
⑦向吸附柱内加入康为世纪试剂盒自带的Buffer RW2 500 μL，4 ℃12 000 r/min离心1 min，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；
⑧将含有吸附柱的收集管重新放回到离心机，4 ℃12 000 r/min离心1 min，充分去除吸附在膜上的液体；
⑨吸附柱RM转入到RNase-Free的2 mL离心管中，于膜的中间部位悬空滴加RNase-Free ddH2O 30～50 μL，室温放置2 min；
⑩于4 ℃离心机中最大转速离心1 min，所得液体即为RNA溶液。
1.3 总RNA纯度及完整性检测
1.3.1 分光光度法测定。用无RNase的水作为空白对照，取5 μL溶解后的总RNA，用无RNase的水稀释50倍，加入到夹缝比色皿中，使用艾本德公司生产的核酸蛋白测定仪Biophotometer plus检测样品RNA的浓度及纯度。
1.3.2 1%琼脂糖凝胶电泳检测。移取已经溶解的RNA溶液5 μL于1%的琼脂糖凝胶中，在150 V恒压下电泳分离15 min，凝胶成像系统下观察总RNA谱带，以检验RNA的完整性。
2 结果与分析
2.1 总RNA浓度及纯度测定结果
一般来说，较纯净的RNA OD260/OD280为1.8～2.0，若比值低于1.7表明有蛋白或酚类物质污染[13]。该研究将2个试剂盒结合并优化后，从0.1 g油菜种子中提取到的总RNA约为50 μg，RNA产量为0.5 mg/g，核酸蛋白测定仪测定结果表明OD260/OD280介于18～2.0，由此可见，该方法提取的RNA纯度和浓度较高，能够满足后续试验需要。
2.2 琼脂糖凝胶电泳结果
为了检测提取的植物种子总RNA的完整性，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测分析，通过电泳图谱可以看出使用不同方法提取的RNA完整性有较大差别，使用天根试剂盒提取所得的RNA电泳条带弥散严重，而使用康为世纪试剂盒提取后所得到的条带无明显弥散，但18S rRNA降解严重（图1），得不到完整的18S rRNA条带。将2种试剂盒相结合，并对提取方法进行优化后，分离得到的RNA电泳检测结果显示28S RNA与18S RNA 条带带型完整、无弥散现象，且前者的亮度约为后者的2倍（图2）。
上述结果说明，采用2种试剂盒相结合的方法从成熟油菜种子中提取的总RNA具有较高完整性，无明显降解现象，可以满足从分子水平上对油菜种子相关基因进行深入研究的需要，如构建cDNA文库、RNA印迹等。
3 讨论与结论
作为重要的油料作物，油菜种子中含有大量的酚类、蛋白质、多糖及一些目前仍无法确定的次级代谢产物等。这些物质可与RNA结合并形成不溶于水的复杂混合物，该物质能够与RNA发生共聚合反应，从而严重影响RNA的提取质量。因此，获得高纯度高完整性RNA的关键是去除蛋白质等大分子物质，同时有效防止酚类物质氧化[14]，抑制外源和内源RNA酶活性。作为构建cDNA文库、研究遗传等分子生物学的基础，RNA的完整性直接影响后续研究结果。目前常用的试剂盒虽具有操作简单、成本低等优点，但在油菜种子总RNA的提取过程中，存在酚类物质抑制不完全、提取时间长、蛋白类物质去除不干净等弊端，最终导致提取的RNA质量和完整性偏低等现象，进而影响后续试验的进行。
针对目前试剂盒提取RNA的弊端，该研究通过抑制内源RNA酶及多酚类物质、吸附蛋白质、缩短提取时间等方法提高RNA的质量和完整度。该方法选用天根总RNA提取试剂盒RNA plant plus reagent和康为世纪全能型植物RNA提取试剂盒CW2598M相结合，加入β-巯基乙醇来抑制酚类物质氧化和内源RNA酶的活性，康为世纪吸附柱和洗涤液有效吸附RNA并去除多糖类物质，整个试验过程中尽量缩短抽提时间，控制在35 min以内，有效降低了提取过程中的降解和损失，解决了高酚高油类种子样品中RNA提取的技术难点。使用该方法抽提的RNA具有质量高、完整性好等优点，完全能满足后续的全长基因克隆、Northern杂交等分子生物学研究需求。
参考文献
[1] 严明理，刘忠松，官春云，等.一种提取高质量油菜种子和种皮RNA的方法[J].生物技术通报，2007（6）：97-100.
[2] 赵祥祥，刘福霞，唐瑭，等.成熟油菜次生休眠种子RNA的快速高效提取方法[J].扬州大学学报（农业与生命科学版），2013，34（1）：64-67.
[3] 丁勇，刘英，杨鸯鸯，等.油菜种子高质量总RNA提取的一种有效方法[J].华中农业大学学报，2006，25（5）：465-468.
[4] 许本波，谢伶俐，严寒，等.甘蓝型油菜籽粒RNA提取方法的探讨[J].黑龙江农業科学，2007（5）：18-20.
[5] FANG G，HAMMAR S，GRUMET R.A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA[J].Biotechniques，1992，13（1）：52-54，56.
[6] 任增凯，禹山林，杨庆利，等.花生种子总RNA提取的一种有效方法[J].花生学报，2008，37（3）：20-23.
[7] 张容，郑彦峰，吴瑶，等.一种简单有效的植物RNA提取方法[J].遗传，2006，28（5）：583-586.
[8] 赵双宜，吴耀荣，夏光敏.介绍一种简单高效的植物总RNA提取方法[J].遗传，2002，24（3）：337-338.
[9] 吴林，薛建平，徐有明，等.半夏叶片总RNA四种提取方法及效果的比较[J].中草药，2008，39（6）：901-905.
[10] 程水源，陈昆松，杜何为，等.银杏RNA的提取[J].果树学报，2005，22（4）：428-429.
[11] 林玲，杨燕凌，何海福，等.总RNA提取方法的比较与分析[J].武夷科学，2009，25（1）：97-100.
[12] 孙海波，王智慧，刘学群，等.一种适用于油菜、大豆、花生、芝麻四种油料作物种子的RNA提取方法[J].中国油料作物学报，2012，34（4）：353-358.
[13] 刘进元.分子生物学实验指导[M].北京：清华大学出版社，2002：59-61.
[14] 史宝胜，卓丽环.紫叶李叶片总RNA提取方法的改进与比较[J].分子植物育种，2006，4（5）：721-725.
关键词 油菜；成熟种子；RNA提取
中图分类号 S565.4 文献标识码 A 文章编号 0517-6611（2017）13-0143-02
Improvement of RNA Extraction Method from Mature Rapeseeds
GU Si-kai1，2，CHEN Gui-min2，ZHAO Wen-jun2，JI Li-lian1，2* et al
（1.College of Food Science and Engineering， Yangzhou University， Yangzhou， Jiangsu 225127；
2.Jiangsu Collaborative Innovation Center of Ragional Modern Agriculture and Enverinment Protection， Jiangsu Key Laboratory for Eco-agricultural Biotechnology around Hongze Lake， School of Life Science， Huaiyin Normal University， Huai’an， Jiangsu 223300）
Abstract [Objective]To extract high quality RNA from mature rapeseeds.[Method]To improve the RNA extraction method of mature rapeseeds by using two RNA extraction kits， which include RNA plant plus reagent from TIANGEN and CW2598M from KANGWEI， meanwhile， adding β-mercaptoethanol to inhibit the oxidation of phenolic compounds and removing DNA by DNase， using the adsorption column to remove polysaccharides etc. [Result]This method can get RNA with high quality， which can satisfy the requirements of subsequent molecular biology research.[Conclusion]The study provides an efficient method for extracting RNA from mature rapeseeds.
Key words Rape；Mature seeds；RNA extraction
RNA提取技術不仅是分子生物学的重要组成部分，而且是功能基因组学的基础[1]，提取高纯度、高完整度的植物组织RNA是进行基因克隆、RNA序列分析、狭线杂交以及构建cDNA文库研究的前提[2-3]。因此，如何快速高效地获得高质量的RNA成为科研人员关注的问题。
油菜是世界四大油料作物之一，成熟油菜种子中含有大量的脂肪、蛋白质、色素、单宁、多酚等物质，丰富的多酚类物质在RNA提取过程中易形成沉淀并发生褐化反应，同时抑制酶的活性等[4-5]。目前已经报道的RNA提取方法主要包括Trizol法[6]、皂土法[7]、Licl-尿素法[8]、改进SDS法[9]及CTAB法[10]等，这些方法都具有一定的局限性，特别对于次级代谢产物丰富、油脂及蛋白含量较高的材料，在总RNA提取过程中往往存在褐化、降解、低纯度等现象[4，11-12]。针对目前油菜种子RNA提取存在的问题，该研究在前期工作的基础上[2]通过多次试验探索，提出了一种高效快捷的油菜种子RNA提取方法。
1 材料与方法
1.1 材料
供试油菜（甘蓝型）播种于淮阴师范学院科技园，待油菜成熟晾晒后，剥出籽粒备用。
试验操作中所需的离心管、枪头、玻璃瓶、量筒、研钵、研杵、药匙等经高温高压灭菌后用0.1%DEPC室温浸泡处理24 h，再高温高压灭菌2次备用。电泳槽、制胶板、梳子等用3%过氧化氢溶液浸泡24 h，使用前分别用10%和0.1%的RNA酶固相清除剂先后处理5 min，最后用高压灭菌的01%DEPC水清洗3次用于制胶。
RNA plant plus reagent植物总RNA提取试剂盒DP437-02（简称天根试剂盒）购自北京天根生化科技公司；β-巯基乙醇、50×TAE Buffer、RNase-Free ddH2O均购自上海捷瑞生物工程有限公司；康为世纪全能型植物RNA提取试剂盒CW2598M（简称康为世纪试剂盒）、DNaseⅠ、固相清除剂、Gold View、DEPC水均购自康为世纪生物科技有限公司。
1.2 油菜种子总RNA提取方法
1.2.1 试剂盒提取RNA法。
采用的试剂盒分别为天根生化科技公司生产的植物总RNA提取试剂盒RNA plant plus reagent和康为世纪生物科技有限公司生产的全能型植物总RNA提取试剂盒CW2598M，操作方法分别按照各公司的说明书进行。 1.2.2 基于2种试剂盒改良法。
将天根试剂盒和康为世纪试剂盒相结合，并对试验步骤进行优化，具体步骤如下：
①取0.1 g成熟油菜种子放入已经使用液氮预冷的研钵中，并迅速研磨成粉末状；
②在低温状态下将粉末转入至2 mL的离心管中，并迅速加入800 μL含有β-巯基乙醇的RNA plant plus reagent提取液，涡旋振荡至彻底混匀，离心管平放静置5 min；
③将离心管置于已预冷的4 ℃离心机中，12 000 r/min离心2 min；
④上清转移至新的RNase-Free的2 mL离心管中，缓慢加入1/2体积的无水乙醇，颠倒数次至彻底混匀，将混合液和沉淀一起转入康为世纪试剂盒自带的吸附柱RM（Spin Columns RM with Collection Tubes）中；
⑤向吸附柱内加入80 μL康为世纪试剂盒自带的DNase Ⅰ 工作液，室温下反应5 min；
⑥向吸附柱内加入康为世纪试剂盒自带的Buffer RW1 350 μL，4 ℃12 000 r/min离心1 min，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；
⑦向吸附柱内加入康为世纪试剂盒自带的Buffer RW2 500 μL，4 ℃12 000 r/min离心1 min，弃废液，将吸附柱重新放回收集管中；
⑧将含有吸附柱的收集管重新放回到离心机，4 ℃12 000 r/min离心1 min，充分去除吸附在膜上的液体；
⑨吸附柱RM转入到RNase-Free的2 mL离心管中，于膜的中间部位悬空滴加RNase-Free ddH2O 30～50 μL，室温放置2 min；
⑩于4 ℃离心机中最大转速离心1 min，所得液体即为RNA溶液。
1.3 总RNA纯度及完整性检测
1.3.1 分光光度法测定。用无RNase的水作为空白对照，取5 μL溶解后的总RNA，用无RNase的水稀释50倍，加入到夹缝比色皿中，使用艾本德公司生产的核酸蛋白测定仪Biophotometer plus检测样品RNA的浓度及纯度。
1.3.2 1%琼脂糖凝胶电泳检测。移取已经溶解的RNA溶液5 μL于1%的琼脂糖凝胶中，在150 V恒压下电泳分离15 min，凝胶成像系统下观察总RNA谱带，以检验RNA的完整性。
2 结果与分析
2.1 总RNA浓度及纯度测定结果
一般来说，较纯净的RNA OD260/OD280为1.8～2.0，若比值低于1.7表明有蛋白或酚类物质污染[13]。该研究将2个试剂盒结合并优化后，从0.1 g油菜种子中提取到的总RNA约为50 μg，RNA产量为0.5 mg/g，核酸蛋白测定仪测定结果表明OD260/OD280介于18～2.0，由此可见，该方法提取的RNA纯度和浓度较高，能够满足后续试验需要。
2.2 琼脂糖凝胶电泳结果
为了检测提取的植物种子总RNA的完整性，采用1%琼脂糖凝胶电泳检测分析，通过电泳图谱可以看出使用不同方法提取的RNA完整性有较大差别，使用天根试剂盒提取所得的RNA电泳条带弥散严重，而使用康为世纪试剂盒提取后所得到的条带无明显弥散，但18S rRNA降解严重（图1），得不到完整的18S rRNA条带。将2种试剂盒相结合，并对提取方法进行优化后，分离得到的RNA电泳检测结果显示28S RNA与18S RNA 条带带型完整、无弥散现象，且前者的亮度约为后者的2倍（图2）。
上述结果说明，采用2种试剂盒相结合的方法从成熟油菜种子中提取的总RNA具有较高完整性，无明显降解现象，可以满足从分子水平上对油菜种子相关基因进行深入研究的需要，如构建cDNA文库、RNA印迹等。
3 讨论与结论
作为重要的油料作物，油菜种子中含有大量的酚类、蛋白质、多糖及一些目前仍无法确定的次级代谢产物等。这些物质可与RNA结合并形成不溶于水的复杂混合物，该物质能够与RNA发生共聚合反应，从而严重影响RNA的提取质量。因此，获得高纯度高完整性RNA的关键是去除蛋白质等大分子物质，同时有效防止酚类物质氧化[14]，抑制外源和内源RNA酶活性。作为构建cDNA文库、研究遗传等分子生物学的基础，RNA的完整性直接影响后续研究结果。目前常用的试剂盒虽具有操作简单、成本低等优点，但在油菜种子总RNA的提取过程中，存在酚类物质抑制不完全、提取时间长、蛋白类物质去除不干净等弊端，最终导致提取的RNA质量和完整性偏低等现象，进而影响后续试验的进行。
针对目前试剂盒提取RNA的弊端，该研究通过抑制内源RNA酶及多酚类物质、吸附蛋白质、缩短提取时间等方法提高RNA的质量和完整度。该方法选用天根总RNA提取试剂盒RNA plant plus reagent和康为世纪全能型植物RNA提取试剂盒CW2598M相结合，加入β-巯基乙醇来抑制酚类物质氧化和内源RNA酶的活性，康为世纪吸附柱和洗涤液有效吸附RNA并去除多糖类物质，整个试验过程中尽量缩短抽提时间，控制在35 min以内，有效降低了提取过程中的降解和损失，解决了高酚高油类种子样品中RNA提取的技术难点。使用该方法抽提的RNA具有质量高、完整性好等优点，完全能满足后续的全长基因克隆、Northern杂交等分子生物学研究需求。
参考文献
[1] 严明理，刘忠松，官春云，等.一种提取高质量油菜种子和种皮RNA的方法[J].生物技术通报，2007（6）：97-100.
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[3] 丁勇，刘英，杨鸯鸯，等.油菜种子高质量总RNA提取的一种有效方法[J].华中农业大学学报，2006，25（5）：465-468.
[4] 许本波，谢伶俐，严寒，等.甘蓝型油菜籽粒RNA提取方法的探讨[J].黑龙江农業科学，2007（5）：18-20.
[5] FANG G，HAMMAR S，GRUMET R.A quick and inexpensive method for removing polysaccharides from plant genomic DNA[J].Biotechniques，1992，13（1）：52-54，56.
[6] 任增凯，禹山林，杨庆利，等.花生种子总RNA提取的一种有效方法[J].花生学报，2008，37（3）：20-23.
[7] 张容，郑彦峰，吴瑶，等.一种简单有效的植物RNA提取方法[J].遗传，2006，28（5）：583-586.
[8] 赵双宜，吴耀荣，夏光敏.介绍一种简单高效的植物总RNA提取方法[J].遗传，2002，24（3）：337-338.
[9] 吴林，薛建平，徐有明，等.半夏叶片总RNA四种提取方法及效果的比较[J].中草药，2008，39（6）：901-905.
[10] 程水源，陈昆松，杜何为，等.银杏RNA的提取[J].果树学报，2005，22（4）：428-429.
[11] 林玲，杨燕凌，何海福，等.总RNA提取方法的比较与分析[J].武夷科学，2009，25（1）：97-100.
[12] 孙海波，王智慧，刘学群，等.一种适用于油菜、大豆、花生、芝麻四种油料作物种子的RNA提取方法[J].中国油料作物学报，2012，34（4）：353-358.
[13] 刘进元.分子生物学实验指导[M].北京：清华大学出版社，2002：59-61.
[14] 史宝胜，卓丽环.紫叶李叶片总RNA提取方法的改进与比较[J].分子植物育种，2006，4（5）：721-725.