论文部分内容阅读
摘要：
以6个甘蓝杂交种为试材，采用游离小孢子培养方法，研究影响胚状体发生的因素。结果表明：花蕾长度为3.00～4.00 mm 时，有利于获得胚状体；1 500 r/min离心、32.5℃热激24 h，最有利于胚状体的诱导；花蕾经低温4℃预处理 24 h，可提高胚诱导率；低速振荡培养能够促进胚状体发生；基因型在小孢子胚状体诱导中起着主导作用。
关键词：甘蓝；小孢子培养；胚状体
中图分类号：S635.036文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）02-0021-05
AbstractTaking 6 cabbage hybrids as experimental materials， the influence factors of somatic embryogenesis were studied by isolated microspore culture method. The results showed that the flower bud length in the range of 3.00～4.00 mm was favorable to obtain embryoid； when centrifugation at the speed of 1 500 r/min and heat shocking at 32.5℃ for 24 hours， it was the most beneficial to the induction of embryoid； when the flower buds were pretreated at 4℃ for 24 hours， the embryo induction rate could be improved； low oscillation culture could promote the embryogenesis. Genotype played a dominant role in microspore embryoid induction.
Key wordsCabbage； Microspore culture； Embryoid
甘蓝是云南省一种主要的十字花科蔬菜作物，是人们日常生活必不可少的蔬菜。甘蓝类植物具有明显的杂种优势，目前市场上出现的栽培品种多为F1杂交种，选育杂交品种已成为目前甘蓝育种的主要方向1。选育杂交品种需要纯合的自交系作为亲本进行组配，自交系的选育依靠常规技术育种（系统选育获得自交不亲和系）耗时长、效率低，通过游离小孢子培养方法，可在1～2年内获得稳定的纯合自交系，育种周期缩短，育种效率提高，隐性性状分离，育种资源丰富2。因此，游离小孢子培养技术是甘蓝类作物育种的一条有效途径。
Lichter3首次成功地在甘蓝型油菜上通过小孢子培养形成植株；Sato等4首次成功地通过大白菜游离小孢子培养形成再生植株；Takahata和Keller5对3种花青菜的供体植株进行低温处理，然后再进行小孢子培养获得胚状体；张德双等6在绿菜花游离小孢子的培养中获得再生植株。甘蓝游离小孢子培养在国内已有报道，但甘蓝游离小孢子培养受诸多因素影响，出胚率低7 。本试验对甘蓝小孢子胚状体发生过程中的影响因素进行研究，以提高甘蓝小孢子出胚率，为甘蓝类植物小孢子培养技术应用提供参考。
1材料与方法
1.1试验材料
供试的6个甘蓝杂交种MWZS13006、MWZS13007、G1、G3、G5、G13由云南省农业科学院园艺所十字花科课题组提供，于2012年10月种植于云南省农业科学院十字花科课题基地，2013年4月陆续开花。
1.2试验方法
1.2.1取材、消毒、小孢子培养于盛花期晴天上午 9∶00～10∶00取健壮植株的饱满花蕾，进行低温处理。经表面消毒后，将花蕾放入无菌研钵中，加入少量 B5培养液，用无菌研棒挤压花蕾，使小孢子分散出来，将研钵中的液体倒入封有滤膜的离心管中，离心3 min，弃上清液，用 B5培养液洗涤沉淀，振荡混匀，离心，重复 2 次。弃上清液，所得沉淀物即为纯净的小孢子群体。将纯化的小孢子用NLN-13 培养液稀释，浓度调至 1×105个/mL ，吸取2 mL培养液于直径 6 cm的培养皿中进行培养，无菌封口膜封口。高温热激后，显微镜下观察细胞膨大情况，选择合适的时期放入 25℃下黑暗静置培养，两周后，统计小孢子胚状体数并观察出胚情况。
1.2.2花蕾长度对小孢子出胚的影响以MWZS13006和MWZS13007为试材，取健壮植株的饱满花蕾，按长度将其分成2.00～2.50、2.60～2.90、3.00～4.00、4.10～4.50、4.60～5.00 mm 5个范围，在显微镜下观察细胞结构，以确定出胚率高的单核靠边期小孢子的花蕾长度。
1.2.3花蕾低温预处理时间对小孢子出胚效果的影响以MWZS13006和MWZS13007为试材，采集花蕾置于 4℃冰箱中低温预处理 0 （CK）、24、48、72、96 h后，在1 500 r/min离心、32.5℃热激24 h条件下进行小孢子培养，研究4℃低温预处理时间对小孢子出胚率的影响。
1.2.4离心转速对小孢子出胚效果的影响以MWZS13006和MWZS13007为试材，低温预处理24 h，离心机转速分别设为1 000、1 200、1 500、2 000、2 500 r/min，离心时间均为3 min，32.5℃热激24 h，观察不同转速对小孢子分离和培养的影响。
1.2.5热激温度和时间对小孢子出胚效果的影响以MWZS13006为试材，在低温预处理24 h、离心转速为1 500 r/min条件下，设定30.0、32.5、35.0、40.0℃ 4个热激温度，处理时间设定为24、48、72 h，之后于25℃暗培养至出胚，统计出胚数量，分析不同热激温度和时间对甘蓝小孢子出胚率的影响。 1.2.6振荡培养对小孢子出胚效果的影响以MWZS13006和MWZS13007为试材，在低温预处理24 h、1 500 r/min离心、32.5℃热激24 h条件下，小孢子培养 20 d 用肉眼可见胚状体形成时，取其中一部分培养皿于 25℃条件下摇床（50 r/min）继续暗培养，7 d 后统计各个发育阶段的胚状体数目，以静置培养为对照（CK），分析振荡培养对胚状体发生和发育的影响。
1.2.7基因型对小孢子出胚效果的影响用 NLN-13 培养液对6个不同基因型甘蓝品种MWZS13006、MWZS13007、G1、G3、G5、G13，在低温预处理24 h、1 500 r/min离心、32.5℃热激24 h条件下进行游离小孢子培养，比较不同基因型小孢子的出胚率。
2结果与分析
2.1甘蓝MWZS13006、MWZS13007小孢子胚状体类型
供试材料分离的小孢子在 NLN-13 培养基中，经高温热激转入25℃暗培养，15 d左右部分小孢子开始膨大，肉眼观察可以看到白色的细小颗粒，25 d 左右小孢子膨大至细胞壁破裂，形成球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶形胚及一小部分畸形发育的胚，如图1所示。
2.2花蕾长度对小孢子出胚的影响
甘蓝小孢子培养诱导胚状体的适宜时期为单核靠边期，细胞外形为圆形。花蕾长度反映小孢子发育时期，选取长度合适的花蕾是小孢子胚状体培养成功的关键。本试验对 2 份甘蓝材料不同长度花蕾的小孢子发育阶段进行观察，结果如表1所示。在划分的5个长度范围内，花蕾长度为3.00～4.00 mm 时，小孢子所处单核靠边期的比例最高，达 80%；花蕾长度为2.00～2.50 mm 时，单核靠边期所占的比例最低。因此，在甘蓝小孢子培养时，花蕾长度应集中在3.00～4.00 mm 范围内，有利于成功获得胚状体。
2.3花蕾低温预处理对小孢子胚发生的影响
由表2可知，4℃低温预处理 24、48 h，胚诱导率均高于对照，而低温预处理 72、96 h 后，胚诱导率反而下降。可见，花蕾低温预处理24 h最有利于获得胚状体。
2.4不同转速对小孢子出胚的影响
由表3可知，当离心转速1 200、1 500 、2 000 r/min时，MWZS13006和MWZS13007均可诱导出胚，其中转速为1 200 r/min出胚数为0.08个/蕾；转速为1 500 r/min 时，出胚数为0.18 个/蕾，镜检观察沉淀为淡黄色，无杂质，小孢子悬浊液孢子密度适中，出胚效果最好；转速为2 000 r/min 时，出胚数为 0.01个/蕾，离心后沉淀中有绿色杂质，少数细胞出现破裂。当离心转速为1 000、2 500 r/min时均未诱导出胚 。由此可见，当离心转速为1 500 r/min时，最适宜小孢子的分离和出胚。
2.5不同热激温度和时间对小孢子胚状体的影响
由表4可知，不同热激温度和时间对小孢子胚状体再生影响不同。当热激温度在 32.5℃时，平均出胚效果最好，为0.34个/蕾，与其它处理温度相比差异显著。当处理为24 h时，出胚效果最好，为 0.23个/蕾，与48 h处理差异不显著，但与72 h处理差异显著。试验发现，当热激温度为32.5℃、时间为24 h 时，甘蓝的出胚效果最好，为0.62个/蕾。32.5℃热激处理24 h和未经过热激处理的小孢子在显微镜下对比见图2和图3。
2.6振荡培养对小孢子出胚发育的影响
由表5所示，2 个材料经过振荡培养后小孢子胚诱导率都有提高，说明振荡培养能够提高胚诱导率。
2.7基因型对小孢子胚发生的影响
由表6可以看出，供试6个不同基因型甘蓝中，有5个基因型的甘蓝小孢子诱导出胚状体，经Duncan’s新复极差测验，MWZS13006、MWZS13007在5%和1%显著水平上均无显著差异；但二者与G1、G3、G5均差异极显著；G13多次重复培养均不能获得胚状体。因此，基因型在小孢子胚状体诱导中起着主导作用。
3小结
目前游离小孢子培养技术在国内外多种蔬菜作物中获得研究并开始应用，大多数研究认为供试材料的基因型决定着出胚产量和质量，是影响小孢子培养的主要因素8，9 。在本试验的6种不同基因型材料中，5个基因型甘蓝获得了小孢子胚状体，但不同品种的小孢子胚诱导率有差异，最高的MWZS13006和最低的G5两者胚诱导率相差达 0.67个/蕾，差异极显著，说明小孢子胚状体诱导基因型起着主导作用 ，此结果与前人结论相一致。
本研究发现，当转速低于1 200 r/min，沉淀效果差，每个花蕾出胚数低；当转速高于1 500 r/min离心后沉淀中有绿色杂质，有的细胞出现破裂，出胚效果很差；离心转速为1 500 r/min，沉淀为淡黄色，无杂质，小孢子悬浊液孢子密度适中，出胚效果最好，为甘蓝小孢子诱导胚状体的最适离心转速。悬浮好的小孢子在32.5℃热激处理24 h 最有利于胚状体的诱导，当热激温度高于35℃ 时，高温导致小孢子大量死亡，无胚状体发生，从而使胚状体诱导失败，这与胡靖锋等10抗根肿病大白菜小孢子培养的研究结论一致。4℃低温预处理 24 h 能够提高胚诱导率，这与王超楠等11在球茎甘蓝小孢子培养中的结论一致。低速振荡培养比静置培养能够更好地促进胚状体的发生，这与王玉书12在羽衣甘蓝小孢子培养中的结论相符。
本试验发现，甘蓝类蔬菜小孢子培养，选取长度合适的花蕾是小孢子胚状体培养成功的关键，这与李梅等13的结论一致；油菜和白菜游离小孢子培养诱导胚状体和再生植株形成的研究结果14～16得出，单核靠边期和双核早期是小孢子胚状体诱导形成的最有利时期。本试验结果也表明，甘蓝花蕾在3.00～4.00 mm时，细胞单核靠边期和单核早期的所占比例最高，有利于成功获得胚状体。 参考文献：
[1]
陈秋芳，贾宏汝.十字花科植物的研究价值及开发利用前景[J].安徽农业科学，2007，35（34）：11183-11185.
[2]袁素霞，刘玉梅，方智远，等.结球甘蓝和青花菜小孢子胚植株再生[J].植物学报， 2010，45（2）：226-232.
[3]Lichter R. Induction of haploid plant from isolated pollen of Brassica napu[J]. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie， 1982，105：427-434.
[4] Sato T， Nishio T， Hirai M. Plant regeneration from isolation microspore of Chinese cabbage （Brassica campestris ssp.pekinensis）[J].Plant Cell Reports，1989，8：468-488.
[5]Takahata Y， Keller W A. High frequency embryogenesis and plant regeneration in isolated microspore culture of Brassica oleracea L.[J]. Plant Sci.，1991， 74：235-242.
[6]张德双，曹鸣庆，秦智伟，等.绿菜花游离小孢子培养、胚胎发生和植株再生[J].华北农学报， 1998， 13（3）：102-106.
[7]桑玉芳，张恩慧，杨安平，等.甘蓝游离小孢子培养中影响胚状体形成的主要因素[J].西北农业学报，2007，16（2）：125-129.
[8]韩阳，叶雪凌，冯辉，等.大白菜小孢子培养影响因素研究[J].中国蔬菜，2006（7）：16-18.
[9]李浩杰，蒲晓斌，张锦芳，等.甘蓝型油菜NER游离小孢子培养能力研究[J].西南农业学报，2009，22（6）：1518-1521.
[10]胡靖锋，戴永娟，汪骞，等.抗根肿病大白菜小孢子培养优化条件研究[J].江西农业大学学报，2011，33（5）：893-898.
[11]王超楠， 闻凤英，刘晓晖，等.球茎甘蓝小孢子培养中影响胚诱导的几个因素[J].中国蔬菜， 2010（10）：35-39.
[12]王玉书.羽衣甘蓝小孢子培养及红叶性状的SRAP标记[D]. 沈阳： 沈阳农业大学，2012.
[13]李梅，孙德岭，赵前程，等.甘蓝类蔬菜游离小孢子培养研究回顾与展望[J].天津农业科学，2004，10（1）：41-44.
[14] 粟根义，高睦枪，赵秀山，等.大白菜游离小孢子培养[J].园艺学报，1993，20（2）：167-170.
[15]官春云.油菜小孢子培养和双单倍体育种研究.Ⅰ.供体植株和小孢子密度对小孢子培养的影响[J]. 作物学报，1995（21）：666-670.
[16]李栒，官春云，陈社元，等.油菜小孢子培养和双单倍体育种研究.Ⅱ.影响甘蓝型油菜和芥菜型油菜种间杂种胚产量的因素[J].作物学报，2003，29（5）：744-749.
以6个甘蓝杂交种为试材，采用游离小孢子培养方法，研究影响胚状体发生的因素。结果表明：花蕾长度为3.00～4.00 mm 时，有利于获得胚状体；1 500 r/min离心、32.5℃热激24 h，最有利于胚状体的诱导；花蕾经低温4℃预处理 24 h，可提高胚诱导率；低速振荡培养能够促进胚状体发生；基因型在小孢子胚状体诱导中起着主导作用。
关键词：甘蓝；小孢子培养；胚状体
中图分类号：S635.036文献标识号：A文章编号：1001-4942（2015）02-0021-05
AbstractTaking 6 cabbage hybrids as experimental materials， the influence factors of somatic embryogenesis were studied by isolated microspore culture method. The results showed that the flower bud length in the range of 3.00～4.00 mm was favorable to obtain embryoid； when centrifugation at the speed of 1 500 r/min and heat shocking at 32.5℃ for 24 hours， it was the most beneficial to the induction of embryoid； when the flower buds were pretreated at 4℃ for 24 hours， the embryo induction rate could be improved； low oscillation culture could promote the embryogenesis. Genotype played a dominant role in microspore embryoid induction.
Key wordsCabbage； Microspore culture； Embryoid
甘蓝是云南省一种主要的十字花科蔬菜作物，是人们日常生活必不可少的蔬菜。甘蓝类植物具有明显的杂种优势，目前市场上出现的栽培品种多为F1杂交种，选育杂交品种已成为目前甘蓝育种的主要方向1。选育杂交品种需要纯合的自交系作为亲本进行组配，自交系的选育依靠常规技术育种（系统选育获得自交不亲和系）耗时长、效率低，通过游离小孢子培养方法，可在1～2年内获得稳定的纯合自交系，育种周期缩短，育种效率提高，隐性性状分离，育种资源丰富2。因此，游离小孢子培养技术是甘蓝类作物育种的一条有效途径。
Lichter3首次成功地在甘蓝型油菜上通过小孢子培养形成植株；Sato等4首次成功地通过大白菜游离小孢子培养形成再生植株；Takahata和Keller5对3种花青菜的供体植株进行低温处理，然后再进行小孢子培养获得胚状体；张德双等6在绿菜花游离小孢子的培养中获得再生植株。甘蓝游离小孢子培养在国内已有报道，但甘蓝游离小孢子培养受诸多因素影响，出胚率低7 。本试验对甘蓝小孢子胚状体发生过程中的影响因素进行研究，以提高甘蓝小孢子出胚率，为甘蓝类植物小孢子培养技术应用提供参考。
1材料与方法
1.1试验材料
供试的6个甘蓝杂交种MWZS13006、MWZS13007、G1、G3、G5、G13由云南省农业科学院园艺所十字花科课题组提供，于2012年10月种植于云南省农业科学院十字花科课题基地，2013年4月陆续开花。
1.2试验方法
1.2.1取材、消毒、小孢子培养于盛花期晴天上午 9∶00～10∶00取健壮植株的饱满花蕾，进行低温处理。经表面消毒后，将花蕾放入无菌研钵中，加入少量 B5培养液，用无菌研棒挤压花蕾，使小孢子分散出来，将研钵中的液体倒入封有滤膜的离心管中，离心3 min，弃上清液，用 B5培养液洗涤沉淀，振荡混匀，离心，重复 2 次。弃上清液，所得沉淀物即为纯净的小孢子群体。将纯化的小孢子用NLN-13 培养液稀释，浓度调至 1×105个/mL ，吸取2 mL培养液于直径 6 cm的培养皿中进行培养，无菌封口膜封口。高温热激后，显微镜下观察细胞膨大情况，选择合适的时期放入 25℃下黑暗静置培养，两周后，统计小孢子胚状体数并观察出胚情况。
1.2.2花蕾长度对小孢子出胚的影响以MWZS13006和MWZS13007为试材，取健壮植株的饱满花蕾，按长度将其分成2.00～2.50、2.60～2.90、3.00～4.00、4.10～4.50、4.60～5.00 mm 5个范围，在显微镜下观察细胞结构，以确定出胚率高的单核靠边期小孢子的花蕾长度。
1.2.3花蕾低温预处理时间对小孢子出胚效果的影响以MWZS13006和MWZS13007为试材，采集花蕾置于 4℃冰箱中低温预处理 0 （CK）、24、48、72、96 h后，在1 500 r/min离心、32.5℃热激24 h条件下进行小孢子培养，研究4℃低温预处理时间对小孢子出胚率的影响。
1.2.4离心转速对小孢子出胚效果的影响以MWZS13006和MWZS13007为试材，低温预处理24 h，离心机转速分别设为1 000、1 200、1 500、2 000、2 500 r/min，离心时间均为3 min，32.5℃热激24 h，观察不同转速对小孢子分离和培养的影响。
1.2.5热激温度和时间对小孢子出胚效果的影响以MWZS13006为试材，在低温预处理24 h、离心转速为1 500 r/min条件下，设定30.0、32.5、35.0、40.0℃ 4个热激温度，处理时间设定为24、48、72 h，之后于25℃暗培养至出胚，统计出胚数量，分析不同热激温度和时间对甘蓝小孢子出胚率的影响。 1.2.6振荡培养对小孢子出胚效果的影响以MWZS13006和MWZS13007为试材，在低温预处理24 h、1 500 r/min离心、32.5℃热激24 h条件下，小孢子培养 20 d 用肉眼可见胚状体形成时，取其中一部分培养皿于 25℃条件下摇床（50 r/min）继续暗培养，7 d 后统计各个发育阶段的胚状体数目，以静置培养为对照（CK），分析振荡培养对胚状体发生和发育的影响。
1.2.7基因型对小孢子出胚效果的影响用 NLN-13 培养液对6个不同基因型甘蓝品种MWZS13006、MWZS13007、G1、G3、G5、G13，在低温预处理24 h、1 500 r/min离心、32.5℃热激24 h条件下进行游离小孢子培养，比较不同基因型小孢子的出胚率。
2结果与分析
2.1甘蓝MWZS13006、MWZS13007小孢子胚状体类型
供试材料分离的小孢子在 NLN-13 培养基中，经高温热激转入25℃暗培养，15 d左右部分小孢子开始膨大，肉眼观察可以看到白色的细小颗粒，25 d 左右小孢子膨大至细胞壁破裂，形成球形胚、心形胚、鱼雷形胚、子叶形胚及一小部分畸形发育的胚，如图1所示。
2.2花蕾长度对小孢子出胚的影响
甘蓝小孢子培养诱导胚状体的适宜时期为单核靠边期，细胞外形为圆形。花蕾长度反映小孢子发育时期，选取长度合适的花蕾是小孢子胚状体培养成功的关键。本试验对 2 份甘蓝材料不同长度花蕾的小孢子发育阶段进行观察，结果如表1所示。在划分的5个长度范围内，花蕾长度为3.00～4.00 mm 时，小孢子所处单核靠边期的比例最高，达 80%；花蕾长度为2.00～2.50 mm 时，单核靠边期所占的比例最低。因此，在甘蓝小孢子培养时，花蕾长度应集中在3.00～4.00 mm 范围内，有利于成功获得胚状体。
2.3花蕾低温预处理对小孢子胚发生的影响
由表2可知，4℃低温预处理 24、48 h，胚诱导率均高于对照，而低温预处理 72、96 h 后，胚诱导率反而下降。可见，花蕾低温预处理24 h最有利于获得胚状体。
2.4不同转速对小孢子出胚的影响
由表3可知，当离心转速1 200、1 500 、2 000 r/min时，MWZS13006和MWZS13007均可诱导出胚，其中转速为1 200 r/min出胚数为0.08个/蕾；转速为1 500 r/min 时，出胚数为0.18 个/蕾，镜检观察沉淀为淡黄色，无杂质，小孢子悬浊液孢子密度适中，出胚效果最好；转速为2 000 r/min 时，出胚数为 0.01个/蕾，离心后沉淀中有绿色杂质，少数细胞出现破裂。当离心转速为1 000、2 500 r/min时均未诱导出胚 。由此可见，当离心转速为1 500 r/min时，最适宜小孢子的分离和出胚。
2.5不同热激温度和时间对小孢子胚状体的影响
由表4可知，不同热激温度和时间对小孢子胚状体再生影响不同。当热激温度在 32.5℃时，平均出胚效果最好，为0.34个/蕾，与其它处理温度相比差异显著。当处理为24 h时，出胚效果最好，为 0.23个/蕾，与48 h处理差异不显著，但与72 h处理差异显著。试验发现，当热激温度为32.5℃、时间为24 h 时，甘蓝的出胚效果最好，为0.62个/蕾。32.5℃热激处理24 h和未经过热激处理的小孢子在显微镜下对比见图2和图3。
2.6振荡培养对小孢子出胚发育的影响
由表5所示，2 个材料经过振荡培养后小孢子胚诱导率都有提高，说明振荡培养能够提高胚诱导率。
2.7基因型对小孢子胚发生的影响
由表6可以看出，供试6个不同基因型甘蓝中，有5个基因型的甘蓝小孢子诱导出胚状体，经Duncan’s新复极差测验，MWZS13006、MWZS13007在5%和1%显著水平上均无显著差异；但二者与G1、G3、G5均差异极显著；G13多次重复培养均不能获得胚状体。因此，基因型在小孢子胚状体诱导中起着主导作用。
3小结
目前游离小孢子培养技术在国内外多种蔬菜作物中获得研究并开始应用，大多数研究认为供试材料的基因型决定着出胚产量和质量，是影响小孢子培养的主要因素8，9 。在本试验的6种不同基因型材料中，5个基因型甘蓝获得了小孢子胚状体，但不同品种的小孢子胚诱导率有差异，最高的MWZS13006和最低的G5两者胚诱导率相差达 0.67个/蕾，差异极显著，说明小孢子胚状体诱导基因型起着主导作用 ，此结果与前人结论相一致。
本研究发现，当转速低于1 200 r/min，沉淀效果差，每个花蕾出胚数低；当转速高于1 500 r/min离心后沉淀中有绿色杂质，有的细胞出现破裂，出胚效果很差；离心转速为1 500 r/min，沉淀为淡黄色，无杂质，小孢子悬浊液孢子密度适中，出胚效果最好，为甘蓝小孢子诱导胚状体的最适离心转速。悬浮好的小孢子在32.5℃热激处理24 h 最有利于胚状体的诱导，当热激温度高于35℃ 时，高温导致小孢子大量死亡，无胚状体发生，从而使胚状体诱导失败，这与胡靖锋等10抗根肿病大白菜小孢子培养的研究结论一致。4℃低温预处理 24 h 能够提高胚诱导率，这与王超楠等11在球茎甘蓝小孢子培养中的结论一致。低速振荡培养比静置培养能够更好地促进胚状体的发生，这与王玉书12在羽衣甘蓝小孢子培养中的结论相符。
本试验发现，甘蓝类蔬菜小孢子培养，选取长度合适的花蕾是小孢子胚状体培养成功的关键，这与李梅等13的结论一致；油菜和白菜游离小孢子培养诱导胚状体和再生植株形成的研究结果14～16得出，单核靠边期和双核早期是小孢子胚状体诱导形成的最有利时期。本试验结果也表明，甘蓝花蕾在3.00～4.00 mm时，细胞单核靠边期和单核早期的所占比例最高，有利于成功获得胚状体。 参考文献：
[1]
陈秋芳，贾宏汝.十字花科植物的研究价值及开发利用前景[J].安徽农业科学，2007，35（34）：11183-11185.
[2]袁素霞，刘玉梅，方智远，等.结球甘蓝和青花菜小孢子胚植株再生[J].植物学报， 2010，45（2）：226-232.
[3]Lichter R. Induction of haploid plant from isolated pollen of Brassica napu[J]. Zeitschrift für Pflanzenphysiologie， 1982，105：427-434.
[4] Sato T， Nishio T， Hirai M. Plant regeneration from isolation microspore of Chinese cabbage （Brassica campestris ssp.pekinensis）[J].Plant Cell Reports，1989，8：468-488.
[5]Takahata Y， Keller W A. High frequency embryogenesis and plant regeneration in isolated microspore culture of Brassica oleracea L.[J]. Plant Sci.，1991， 74：235-242.
[6]张德双，曹鸣庆，秦智伟，等.绿菜花游离小孢子培养、胚胎发生和植株再生[J].华北农学报， 1998， 13（3）：102-106.
[7]桑玉芳，张恩慧，杨安平，等.甘蓝游离小孢子培养中影响胚状体形成的主要因素[J].西北农业学报，2007，16（2）：125-129.
[8]韩阳，叶雪凌，冯辉，等.大白菜小孢子培养影响因素研究[J].中国蔬菜，2006（7）：16-18.
[9]李浩杰，蒲晓斌，张锦芳，等.甘蓝型油菜NER游离小孢子培养能力研究[J].西南农业学报，2009，22（6）：1518-1521.
[10]胡靖锋，戴永娟，汪骞，等.抗根肿病大白菜小孢子培养优化条件研究[J].江西农业大学学报，2011，33（5）：893-898.
[11]王超楠， 闻凤英，刘晓晖，等.球茎甘蓝小孢子培养中影响胚诱导的几个因素[J].中国蔬菜， 2010（10）：35-39.
[12]王玉书.羽衣甘蓝小孢子培养及红叶性状的SRAP标记[D]. 沈阳： 沈阳农业大学，2012.
[13]李梅，孙德岭，赵前程，等.甘蓝类蔬菜游离小孢子培养研究回顾与展望[J].天津农业科学，2004，10（1）：41-44.
[14] 粟根义，高睦枪，赵秀山，等.大白菜游离小孢子培养[J].园艺学报，1993，20（2）：167-170.
[15]官春云.油菜小孢子培养和双单倍体育种研究.Ⅰ.供体植株和小孢子密度对小孢子培养的影响[J]. 作物学报，1995（21）：666-670.
[16]李栒，官春云，陈社元，等.油菜小孢子培养和双单倍体育种研究.Ⅱ.影响甘蓝型油菜和芥菜型油菜种间杂种胚产量的因素[J].作物学报，2003，29（5）：744-749.