【摘 要】
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目的:建立测定人体红细胞(RBC)内核苷二磷酸激酶(NDPK)活性的反相离子对高效液相色谱法。方法:稀释RBC中加入反应底物(dADP和dGTP)及其他反应混合液后,37℃孵育5 min,100℃灭
【机 构】
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华中科技大学同济医学院附属协和医院药剂科; 华中科技大学同济医学院; 华中科技大学同济医学院临床药理研究所;
【基金项目】
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湖北省自然科学基金资助项目(编号:2009CDB380);中央高校基本科研业务费专项资金资助(编号:2011JC039)
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目的:建立测定人体红细胞(RBC)内核苷二磷酸激酶(NDPK)活性的反相离子对高效液相色谱法。方法:稀释RBC中加入反应底物(dADP和dGTP)及其他反应混合液后,37℃孵育5 min,100℃灭活10 min,离心取上清液进样分析。以反应产物dATP定量分析NDPK活性。色谱柱为SymmetryShield TMRP18(150 mm×3.9 mm,5μm),检测波长为260 nm,柱温为25℃;采用梯度洗脱,流动相A为20 mmol.L-1 KH2PO4-K2HPO4缓冲液、加入离子对试剂5 mmol.L-1四丁基硫酸氢铵(TBAHS)溶液,流动相B为乙腈。结果:NDPK催化反应dADP+dGTPdATP+dGDP反应特异性良好,RBC内dATP的线性范围为4.33～43.34μmol.L-1(r2=1.000),定量下限为4.33μmol.L-1。日内及日间RSD分别小于5.53%和6.69%,准确度为98.4%～104.2%,平均绝对回收率大于83%;dATP样品在室温或4℃、-80℃保存30 d及反复冻融3次稳定性良好。结论:该法操作简便快速、灵敏、专属性强,可应用于人体RBC内NDPK活性测定,为研究NDPK活性与嘌呤类药物反应相关性提供基础。
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