【摘 要】
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目的 探讨东方田鼠(Microtus fortis)骨髓E77.43基因片段(MfE77.43)对日本血吸虫(Schistosoma japonicum)攻击感染的抵抗作用. 方法 将MfE77.43构建至重组腺相关病毒(AAV2)载
【机 构】
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益阳医学高等专科学校,益阳,413002;中南大学生命科学学院分子生物学研究中心,长沙,410008;中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所,世界卫生组织热带病合作中心,科技部国家级热带病国际联合研究
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目的 探讨东方田鼠(Microtus fortis)骨髓E77.43基因片段(MfE77.43)对日本血吸虫(Schistosoma japonicum)攻击感染的抵抗作用. 方法 将MfE77.43构建至重组腺相关病毒(AAV2)载体上,磷酸钙共沉淀法转染HEK293细胞,纯化重组病毒rAAV2-MfE77.43后,提取转染后细胞总RNA,RT-PCR检测E77.43基因表达情况,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析rAAV2-MfE77.43纯度.将18只昆明小鼠随机分为3组,每组6只,实验组每鼠于第0、3、7天肌内注射生理盐水稀释5倍的rAAV2-MfE77.43病毒液400μl,阴性对照组和空白对照分别注射等量pAAV空载体和生理盐水.每次注射前取小鼠尾静脉血,斑点ELISA法检测小鼠血浆中E77.43表达情况.末次注射后,用日本血吸虫尾蚴经小鼠腹部贴片进行攻击感染,40条/鼠.感染后第41天,剖杀小鼠,分别收集各组小鼠的肝脏和小鼠体内的血吸虫成虫,计数成虫数和每克肝脏虫卵数(LEPG),计算减虫率和减卵率,HE染色观察肝脏虫卵肉芽肿病理特征. 结果 RT-PCR检测获得约330 bp的目的DNA片段.SDS-PAGE分析结果显示,重组病毒rAAV2-MfE77.43外壳蛋白可见3条特征性蛋白条带,相对分子质量(尬)分别为87 000、72 000、62 000,且杂带较少,病毒纯度较好.斑点ELISA法检测结果显示,小鼠注射rAAV2-MfE77.43后第3天,血浆中E77.43蛋白开始表达,且稳定表达至第41天.实验组小鼠体内日本血吸虫成虫数和LEPG分别为20.16±3.93和19 800±2 715,均低于阴性对照组的29.16±2.44和28 000±2 192 (P＜0.01);实验组的减虫率和减卵率分别为27.3％和26.2％.HE染色可见,实验组小鼠肝脏虫卵周围嗜酸粒细胞和浸润炎性细胞较少,并以单个肉芽肿较为多见. 结论 东方田鼠E77.43基因对血吸虫感染具有一定的预防保护效果,提示E77.43基因可能参与东方田鼠天然抵抗日本血吸虫感染.
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