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徐 蓉 范 斌 徐文彬 金 伟 肖秀丽 王一飞
[摘要]目的：通过观察大鼠正常创面与糖尿病模型创面肉芽组织中／GF－β1、TGF－β3不同时段表达水平的差异，探求糖尿病创面“难愈”的可能机制。方法：采用SD大鼠实验性正常创面及糖尿病创面背部全层皮肤缺损模型，分别于不同时段(3天、7天、11天)取材，EnVision二步法免疫组化测定，并行图像扫描定量分析TGF-β1、TGF-β3水平变化。结果：创伤后3天、7天和11天，正常创面模型组TGF-β1表达分别为(25．56±6．86)、(24．79±5．62)和(28．57±6．39)，TGF-β3表达分别为(39．69±5．46)、(23．20±2．45)、(13．69±3．63)。而糖尿病溃疡模型组TGF-β1表达分别为(7．10±3．74)、(9．47±1．72)和(7．87±2．53)，TGF-β3表达分别为(14．99±1．87)、(18．72±5．01)和(8．68±3．39)。糖尿性创面肉芽组织中各时段(3天、7天和11天)TGP-β1及TGF-β3表达水平均低于正常创面组(P＜0．05)。结论：SD大鼠糖尿病创面TGF-β1及TGF-β3的低水平表达，可能是创面愈合迟缓的原因之一。
[关键词]糖尿病：创面愈合；TGFβ
[中图分类号]R641 [文献标识码]A [文章编号]1008—6455(2007)01—0035－03
TGF－β是参与创面愈合全过程的重要因子，近来有国內外研究表明：创面难以愈合往往和生长因子的缺乏有关。我们以SD大鼠实验性正常创面与糖尿病溃疡模型为研究平台，动态观察不同时段新生肉芽组织中TGF－β1、TGF－β3水平的变化，从生长因子水平阐明糖尿病性创面的部分机制。
1 材料和方法
1．1实验动物及分组：48只清洁级SD(sprague-dawly)大鼠，雄性，质量(250±20)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(批号医动字第04-20-3号)。糖尿病造模后随机分为3天、7天和11天三个观测时段。每个时段又分为正常创面生理盐水组、糖尿病创面生理盐水组。每组各8只动物。
1．1．1主要实验试剂和仪器
1．1．2大鼠创面模型制备用药：新洁尔灭酊，0．9％生理盐水(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院提供)。0．1％盐酸氯胺酮(上海中西药业股份公司产品)。四氧嘧啶(Auoxan)，试剂编号：2244-11-3。瑞士FULKA公司产品(由上海中医药大学药理毒性实验室提供)。罗氏ACCU-CHEK ACTIVE血糖仪和血糖测试试纸，编号：2005—10，22896931，瑞士Roche公司产品。 1．1．3免疫组化试剂和仪器：转化生长因子β1多克隆抗体，工作浓度1：200；转化生长因子β3多克隆抗体，工作浓度1：200，均为北京中山生物工程公司产品；二抗抗体(生物素标记的羊抗兔抗体)，工作浓度1：200，美国Vector公司产品。EnVision试剂盒，工作浓度1：100，日本DAKO公司产品。3，3-二氨基联苯胺(DAB)，瑞士Fluke公司产品；BX51／BX52系统显微镜，日本Olympus公司产品。SX-100计算机图像分析系统，美国IBM公司产品。
1．2方法
1．2．1动物实验(上海中医药大学岳阳中西医结合医院动物实验室)
1．2．2糖尿病大鼠模型制备：糖尿病大鼠模型制备参照傅小兵等方法改进动物随机分为对照组和实验组，禁食24h后(饮水不限)，分别在乙醚麻醉下尾静脉一注射1．5％四氧嘧啶(50mg／kg，实验组)及等体积生理盐水(对照组)，造模后4h后给予5％葡萄糖水溶液饮用，次日经尾部取血测血糖，血糖值大于10mmol／L上，则表明造模成功。模型制成后，实验组再随机分三组，每三天测血糖一次，直到动物处死。
1．2．3动物糖尿病创面造模：糖尿病大鼠模型制造完成后三天，参照傅小兵等方法改进，SD大鼠用1％盐酸氯胺酮(0．3ml／100g)腹腔注射麻醉。局部备皮，常规消毒后，于SD大鼠背部取直径为3cm左右圆形切口，剪开皮肤全层，至皮下筋膜，无菌敷料加盖，每日换料一次。
1．2．4动物标本采取：用药后第3天、7天、11天，将动物麻醉(氯胺酮)处死，用眼科手术剪分离新生创面肉芽组织，并成块取下，为所需实验样品。
1．2．5免疫组化实验：(上海复旦大学肿瘤医院病理实验室和上海中医药大学药理毒性实验室)6组(3个吋段，每个时段分2组)标本均用10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，每例分别进行HE染色。(用以对照病理诊断)，并同时、同一试剂进行免疫组化EnVision二步法测定／FGβ1、TGFβ3。
1．2．6EnVision二步法测定：取存档蜡块制成5μm连续切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精至水。将切片移入电饭煲水浴中(内含0．01mol／1 Ph6．0的柠檬三钠缓冲液)，温度保持在95～100℃，煮20min，保温10min，进行抗原修复，取出后在室温下自然冷却。TBS洗涤，5min3次。滴加一抗(分别为上述抗体及相应抗体稀释度)在湿盒中室温下(20℃～25℃)孵肓60min后移入4℃冰箱过夜。TBS洗涤3次。滴加EnVision反应液(抗鼠，抗兔)，50μl／片，室温下孵育30min。TBS洗涤3次。0．05％DAB+0．03％H202显色5～10min。流水洗，苏木素衬染，盐酸酒精分化，蓝化。递增梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规树脂封片。对照设置：显微镜下观察：有棕黄色染者为阳性对照，用TBS代替一抗做阴性对照。
1．2．7免疫组织化学阳性着色的定量分析：染色结果应用Image-pro plus 4．1版本计算机图像分析系统在40倍显微镜下计算区域的阳性面积百分比(％)，求出10个视野平均值(x±s)。统计学处理采用SPSS11．0统计软件包对相关数据进行配对资料均数的双侧t检验，P＜0．05，具有统计学意义。
1．2．8创面面积：采用透明薄膜称量法。创伤后3天、7大、11天，分别用透明薄膜覆盖创面沿创缘画膜，剪膜，置分度值为0．1mg的电子天平称取质量并转换成面积。
2 结果
各治疗组不同时段TGF-β1、TGF-β3水平变化详见表1、2、3。
从以上实验结果可以看出，三个不同时段(3天、7天、11天)，糖尿病创面生理盐水组均低于正常创面生理盐水组(P＜0．05)。
3 讨论
糖尿病是临床常见病、多发病。糖尿病性溃疡，特别是足部溃疡发病率较高，是糖尿病患者的常见并发症之一。造成糖尿病溃疡迁延难愈的原因有很多，可能和局部生长因子缺乏，细胞外基质改变，成纤维细胞功能降低，白细胞的抗菌活性降低和患处体循环、微循环紊乱等有关。其中对生长因子的研究，是目前创面愈合的研究热点。
创伤修复的快慢取决于修复细胞进入伤口和增生的速度，而细胞的进入和增生又依赖于趋化因子和生长因子的参与。转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)是近来创面愈合研究中的热点。它是创面细胞外基质积聚过程中的主导介质，通过激活细胞内smad2和smad3介导的信号通路，诱导细胞内目的基因表达和蛋白合成。
在哺乳类动物中，有三种子GF-β(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)。它们彼此的分子结构不尽相同，结合细胞受体的方式也不同，但却有着相似的生物学活性，对诸如细胞分化、增殖、细胞黏附、骨骼形成、血管生成、炎症反应和创面愈合的调控在生物学方面有着举足轻重的影响。有研究证实TGF-β既可直接作用于成纤维细胞对细胞外基质的蛋白合成，体外低浓度的TGF—β即可刺激成纤维细胞合成大量胶原基质。已有研究表明：糖尿病创面通常表现为修复不足，通过增加TGF-β1的合成与释放，可以增加糖尿病烧伤创面的血管形成，促进创面愈合。
我们的实验结果显示：糖尿病创面的生理盐水组在伤后3～11天的创面中TGF-β1、TGF-β3的表达量始终较低，3天和11天比较几乎没有明显变化(P＜0．05)。而创伤后3天內TGF-β3水平高于TGF=β1(P＜0．05)，可能和创伤后应激反应有关，与文献报道相一致。正常创面组，在创伤后3～11里，TGF-β1一直保持在较高水平，TGF-β3随创面愈合而逐渐下降。正常创面组TGF-β1水平始终高于糖尿病性创面组。研究结果显示糖尿病性创面难以愈合的原因可能与低水平表达的TGF-β有关。
编辑／张惠娟
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。
[摘要]目的：通过观察大鼠正常创面与糖尿病模型创面肉芽组织中／GF－β1、TGF－β3不同时段表达水平的差异，探求糖尿病创面“难愈”的可能机制。方法：采用SD大鼠实验性正常创面及糖尿病创面背部全层皮肤缺损模型，分别于不同时段(3天、7天、11天)取材，EnVision二步法免疫组化测定，并行图像扫描定量分析TGF-β1、TGF-β3水平变化。结果：创伤后3天、7天和11天，正常创面模型组TGF-β1表达分别为(25．56±6．86)、(24．79±5．62)和(28．57±6．39)，TGF-β3表达分别为(39．69±5．46)、(23．20±2．45)、(13．69±3．63)。而糖尿病溃疡模型组TGF-β1表达分别为(7．10±3．74)、(9．47±1．72)和(7．87±2．53)，TGF-β3表达分别为(14．99±1．87)、(18．72±5．01)和(8．68±3．39)。糖尿性创面肉芽组织中各时段(3天、7天和11天)TGP-β1及TGF-β3表达水平均低于正常创面组(P＜0．05)。结论：SD大鼠糖尿病创面TGF-β1及TGF-β3的低水平表达，可能是创面愈合迟缓的原因之一。
[关键词]糖尿病：创面愈合；TGFβ
[中图分类号]R641 [文献标识码]A [文章编号]1008—6455(2007)01—0035－03
TGF－β是参与创面愈合全过程的重要因子，近来有国內外研究表明：创面难以愈合往往和生长因子的缺乏有关。我们以SD大鼠实验性正常创面与糖尿病溃疡模型为研究平台，动态观察不同时段新生肉芽组织中TGF－β1、TGF－β3水平的变化，从生长因子水平阐明糖尿病性创面的部分机制。
1 材料和方法
1．1实验动物及分组：48只清洁级SD(sprague-dawly)大鼠，雄性，质量(250±20)g，由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供(批号医动字第04-20-3号)。糖尿病造模后随机分为3天、7天和11天三个观测时段。每个时段又分为正常创面生理盐水组、糖尿病创面生理盐水组。每组各8只动物。
1．1．1主要实验试剂和仪器
1．1．2大鼠创面模型制备用药：新洁尔灭酊，0．9％生理盐水(上海中医药大学附属岳阳中西医结合医院提供)。0．1％盐酸氯胺酮(上海中西药业股份公司产品)。四氧嘧啶(Auoxan)，试剂编号：2244-11-3。瑞士FULKA公司产品(由上海中医药大学药理毒性实验室提供)。罗氏ACCU-CHEK ACTIVE血糖仪和血糖测试试纸，编号：2005—10，22896931，瑞士Roche公司产品。 1．1．3免疫组化试剂和仪器：转化生长因子β1多克隆抗体，工作浓度1：200；转化生长因子β3多克隆抗体，工作浓度1：200，均为北京中山生物工程公司产品；二抗抗体(生物素标记的羊抗兔抗体)，工作浓度1：200，美国Vector公司产品。EnVision试剂盒，工作浓度1：100，日本DAKO公司产品。3，3-二氨基联苯胺(DAB)，瑞士Fluke公司产品；BX51／BX52系统显微镜，日本Olympus公司产品。SX-100计算机图像分析系统，美国IBM公司产品。
1．2方法
1．2．1动物实验(上海中医药大学岳阳中西医结合医院动物实验室)
1．2．2糖尿病大鼠模型制备：糖尿病大鼠模型制备参照傅小兵等方法改进动物随机分为对照组和实验组，禁食24h后(饮水不限)，分别在乙醚麻醉下尾静脉一注射1．5％四氧嘧啶(50mg／kg，实验组)及等体积生理盐水(对照组)，造模后4h后给予5％葡萄糖水溶液饮用，次日经尾部取血测血糖，血糖值大于10mmol／L上，则表明造模成功。模型制成后，实验组再随机分三组，每三天测血糖一次，直到动物处死。
1．2．3动物糖尿病创面造模：糖尿病大鼠模型制造完成后三天，参照傅小兵等方法改进，SD大鼠用1％盐酸氯胺酮(0．3ml／100g)腹腔注射麻醉。局部备皮，常规消毒后，于SD大鼠背部取直径为3cm左右圆形切口，剪开皮肤全层，至皮下筋膜，无菌敷料加盖，每日换料一次。
1．2．4动物标本采取：用药后第3天、7天、11天，将动物麻醉(氯胺酮)处死，用眼科手术剪分离新生创面肉芽组织，并成块取下，为所需实验样品。
1．2．5免疫组化实验：(上海复旦大学肿瘤医院病理实验室和上海中医药大学药理毒性实验室)6组(3个吋段，每个时段分2组)标本均用10％中性福尔马林固定，石蜡包埋，连续切片，每例分别进行HE染色。(用以对照病理诊断)，并同时、同一试剂进行免疫组化EnVision二步法测定／FGβ1、TGFβ3。
1．2．6EnVision二步法测定：取存档蜡块制成5μm连续切片，二甲苯脱蜡，梯度酒精至水。将切片移入电饭煲水浴中(内含0．01mol／1 Ph6．0的柠檬三钠缓冲液)，温度保持在95～100℃，煮20min，保温10min，进行抗原修复，取出后在室温下自然冷却。TBS洗涤，5min3次。滴加一抗(分别为上述抗体及相应抗体稀释度)在湿盒中室温下(20℃～25℃)孵肓60min后移入4℃冰箱过夜。TBS洗涤3次。滴加EnVision反应液(抗鼠，抗兔)，50μl／片，室温下孵育30min。TBS洗涤3次。0．05％DAB+0．03％H202显色5～10min。流水洗，苏木素衬染，盐酸酒精分化，蓝化。递增梯度酒精脱水，二甲苯透明，常规树脂封片。对照设置：显微镜下观察：有棕黄色染者为阳性对照，用TBS代替一抗做阴性对照。
1．2．7免疫组织化学阳性着色的定量分析：染色结果应用Image-pro plus 4．1版本计算机图像分析系统在40倍显微镜下计算区域的阳性面积百分比(％)，求出10个视野平均值(x±s)。统计学处理采用SPSS11．0统计软件包对相关数据进行配对资料均数的双侧t检验，P＜0．05，具有统计学意义。
1．2．8创面面积：采用透明薄膜称量法。创伤后3天、7大、11天，分别用透明薄膜覆盖创面沿创缘画膜，剪膜，置分度值为0．1mg的电子天平称取质量并转换成面积。
2 结果
各治疗组不同时段TGF-β1、TGF-β3水平变化详见表1、2、3。
从以上实验结果可以看出，三个不同时段(3天、7天、11天)，糖尿病创面生理盐水组均低于正常创面生理盐水组(P＜0．05)。
3 讨论
糖尿病是临床常见病、多发病。糖尿病性溃疡，特别是足部溃疡发病率较高，是糖尿病患者的常见并发症之一。造成糖尿病溃疡迁延难愈的原因有很多，可能和局部生长因子缺乏，细胞外基质改变，成纤维细胞功能降低，白细胞的抗菌活性降低和患处体循环、微循环紊乱等有关。其中对生长因子的研究，是目前创面愈合的研究热点。
创伤修复的快慢取决于修复细胞进入伤口和增生的速度，而细胞的进入和增生又依赖于趋化因子和生长因子的参与。转化生长因子β(transforming growth factorβ，TGF-β)是近来创面愈合研究中的热点。它是创面细胞外基质积聚过程中的主导介质，通过激活细胞内smad2和smad3介导的信号通路，诱导细胞内目的基因表达和蛋白合成。
在哺乳类动物中，有三种子GF-β(TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3)。它们彼此的分子结构不尽相同，结合细胞受体的方式也不同，但却有着相似的生物学活性，对诸如细胞分化、增殖、细胞黏附、骨骼形成、血管生成、炎症反应和创面愈合的调控在生物学方面有着举足轻重的影响。有研究证实TGF-β既可直接作用于成纤维细胞对细胞外基质的蛋白合成，体外低浓度的TGF—β即可刺激成纤维细胞合成大量胶原基质。已有研究表明：糖尿病创面通常表现为修复不足，通过增加TGF-β1的合成与释放，可以增加糖尿病烧伤创面的血管形成，促进创面愈合。
我们的实验结果显示：糖尿病创面的生理盐水组在伤后3～11天的创面中TGF-β1、TGF-β3的表达量始终较低，3天和11天比较几乎没有明显变化(P＜0．05)。而创伤后3天內TGF-β3水平高于TGF=β1(P＜0．05)，可能和创伤后应激反应有关，与文献报道相一致。正常创面组，在创伤后3～11里，TGF-β1一直保持在较高水平，TGF-β3随创面愈合而逐渐下降。正常创面组TGF-β1水平始终高于糖尿病性创面组。研究结果显示糖尿病性创面难以愈合的原因可能与低水平表达的TGF-β有关。
编辑／张惠娟
注：本文中所涉及到的图表、注解、公式等内容请以PDF格式阅读原文。