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【摘要】慢性难愈创面形成机制复杂，治疗困难。随着创面愈合机制的研究进展及新治疗技术的临床应用，此种情况有所改观。本文重点论述了血管内皮生长因子在各种难愈创面的表达变化，及VEGF在治疗难愈创面的最新进展。
【关键词】难愈创面；血管内皮生长因子
难愈创面是指由于各种致伤因素所导致的未能按预期愈合的创面组织，此种现象多发生在接受细胞毒性药物治疗、激素治疗、大面积烧伤、糖尿病及心血管疾病的患者中，在临床治疗方面始终是个难题。难愈创面愈合需要多种细胞及组织来参与，其过程主要包括细胞增殖、转移、炎性改变及重塑创面等环节[1]。
有研究发现，细胞生长因子在创面愈合的整个过程中发挥着非常重要的作用，包括分化、趋化、增殖，最终使创面愈合。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管的生成中最强的调控因素，在新生血管的生成中起着极其重要的作用[2]，它能为新生血管的生成提供营养物质、组织需氧及生物活性物质，进而促进创面愈合。VEGF作用于血管内皮细胞促使血管内皮的迁移及增殖，能够促使心血管的形成，为创面提供血液，促进创面的愈合。本文中笔者对难愈创面治疗中血管内皮生长因子的研究现状进行综述研究。
1VEGF的生物学功能
主要功能：①延长内皮细胞寿命：并促进内皮细胞的增殖和繁殖的能力，降低细胞的蜕变及凋亡[3]。在细胞外VEGF能促进内皮细胞分化、迁移及生长，在细胞内能促进血管生成；VEGF还能短暂地激活细胞上的磷脂酶C、诱导Ca2+离子直接作用于内皮细胞，促进内皮细胞增殖。②增强血管的通透性：VEGF通过促进前列环素和血管内皮细胞NO的合成来增强血管的通透性[4]。VEGF结合Flt1发挥增强血管通透性的效果要比组胺的作用强5万多倍，且其作用短暂、快速，不会发生肥大细胞的颗粒的减少，也不受抗组胺药物的影响。③促进血管生成：VEGF可以升高内皮细胞的钙浓度，使其在短时间内升高、分裂及变性，加速降解基底膜，调控内皮细胞的基因表达，促进血管的重构，还能促进内皮细胞合成大量的蛋白水解酶，通过上述作用促进血管的生成[9]。④血管维持功能：VEGF是主要的内皮细胞调节器，通过调节血管内皮细胞NO，来维持血管的正常状态及功能[5]。⑤VEGF能诱导单核细胞化学迁移及趋化，调控单核细胞，发挥止血的作用；参与间质液引流，还能选择性地促使淋巴管增生[7]。
VEGF通过促进内皮细胞增生、迁移等作用，而促进血管形成，同时，在动静脉的分化中也起着关键的作用。动静脉分化是通过VEGFR2下的两条相互竞争的信号途径（活化磷脂酶C-γ及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径）来实现，通过这两个途径能激活转录因子，直接激化Delta样配体4（Dll4），诱导动脉标记物Dll4和Notch1表达。而丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（PI3K-AKT）/磷脂酰肌醇3激酶能对上述信号进行抑制，促使血管向静脉分化[8-9]。
VEGF能促进血管内皮细胞的迁移、增生，同时还能阻止内皮细胞的凋亡。有实验证实，对特发性肺纤维化大鼠转染VEGF后，肺部血管增加了血管化，减少了内皮细胞的凋亡，并能改善肺动脉高压[10]。VEGF造成血管的去稳定和血管成熟障碍，导致负性作用表现为抑制周细胞在新生出芽血管的覆盖[11]。
2VEGF在难愈创面中的作用机理
2.1VEGF在大面积烧伤创面中的作用机理血管生成在烧伤创面愈合中起着关键的作用。VEGF能促进血管形成，是作用于血管内皮细的多功能、特异性因子，它通过促进血管内皮细胞的迁移、增殖、改变细胞外基质成分、增强血管通透性等多种途径发挥作用。对烧伤患者的研究发现，烧伤后损伤到血管，可促进释放VEGF，使内皮前体细胞从骨髓中快速释放到血液，同时血浆中的VEGF水平也快速升高。血管损伤后血浆内的VEGF一般在伤后的6-12小时达到峰值，48-72小时后会逐渐下降，这与烧伤患者休克期体液渗出的生理病理机制具有一致性[20]。研究健康者和烧伤患者血清中的VEGF浓度显示，烧伤后发生肿胀，血浆中的VEGF水平快速增高，直至消肿后下降，因此，VEGF与严重烧伤患者的体液渗出肿胀关系密切。烧伤后的皮肤组织在缺血、缺氧的环境中促使了VEGF mRNA的表达，通过旁分泌来升高了VEGF受体的水平，进而升高了患者血液中的VEGF，VEGF对烧伤创面有促进愈合的作用。Infanger等[21]表明，烧伤病人在伤后的l-3周内VEGF水平明显升高，在伤后的14d达到一定的峰值，与最初的烧伤严重程度关系不大，而与伤后并发症情况有一定的关系。烧伤部位在修复早期因为组织缺氧，且不同组织是含氧量不同，造成伤处的血管再生进度也不相同，VEGF是再生的主要调节因素。在创伤早期的缺氧阶段，VEGF的水平明显增高，随着新生血管的增多及伤口的不断愈合VEGF水平逐渐降低[22]。在VEGF的作用下，内皮细胞增生，能加快创面炎症反应的进程，快速地清除坏死组织，使修复细胞趋向创面，促进伤口创面的愈合。对烧伤大鼠使用腺病毒当作载体转导VEGF进行治疗，可促进创面上皮细胞血管的生成，证实了VEGF基因转导可以有效地治疗高热损伤[23]。
2.2VEGF在静脉瘀血性溃疡中的作用机理下肢静脉瘀血性溃疡是一种血管源性、退行性、慢性进行性病变，主要病变是下肢静脉高压、静脉血液倒流、静脉血液郁滞。下肢长期淤血，降低了组织的含氧量，增高了血管壁的通透性，部分组织因缺血、缺氧，营养不足，发生纤维化，色素沉着，出现营养不良及免疫功力低下，如果发生损伤，会造成局部出现瘀血性皮炎和溃疡，使伤口很难愈合[17]。当发生静脉溃疡时，该组织缺氧，应激性地升高了VEGF在该部位的组织及血浆中的水平，但是，VEGF在溃疡处的功能状态及其与受体的作用机理临床上尚未研究清楚。Kusumanto等[18]对9例休息痛周围动脉炎和/或缺血溃疡患者进行了肌肉内转基因VEGF治疗，结果发现，9例患者的病情较治疗前有所好转，但发生了短暂性的下肢水肿。 2.3VEGF在缺血心脏病中的作用机理VEGF可以用来治疗冠状动脉缺血性心脏病，VEGF质粒编码直接注射进入患者的心肌可以为心绞痛治疗无效果而改善冠脉血管症状[19]。有研究发现，VEGF在治疗相关性心血管疾病中有较好的临床疗效。对缺血性心肌梗死患者，在心脏梗死区外源性给予VEGF，能提高梗死区的VEGF生成浓度，能促进血管的再生，改善侧支循环血流及心肌的供血。VEGF在血管成形术及手术中得到了有效地管理，并作为辅助治疗措施。另外，VEGF还能增强冠脉血管的通透性、舒张冠脉。有研究发现，使用VEGF抑制抗体有可能诱发深静脉血栓及心脑血管血栓，这提示内源性VEGF可能在成人脉管系统中起到保护作用。
2.4VEGF在糖尿病性创面中的作用机理糖尿病患者发生创伤后创面一般很难愈合，这是临床治疗中的非常棘手的问题。糖尿病患者皮肤组织发生损伤后，引起局部经皮血流量和氧分压（TcPO2）降低。Brem等[13]研究了转基因糖尿病小鼠模型发现，在没有发生损伤的情况下，VEGFmRNA在其皮肤组织中具有高表达。Hortreed等[12]报道，非胰岛素依赖性糖尿病患者肌肉内毛细血管密度明显降低。因此，在皮肤组织发生创伤后，创面周围的VEGF表达水平在初期明显增加，之后逐渐下降，在损伤5天后已经无法检测到VEGF。因此，在正常皮肤组织中VEGF的表达水平较高，而在糖尿病患者伴有皮肤创伤时，动物实验显示，几种合成生长因子的水平降低了，其中主要包括VEGF[14]。在非胰岛素依赖的血糖尿病小鼠模型中，VEGF及蛋白表达降低，抑制了新血管的形成。
糖尿病伤口在愈合的过程中同样要依赖肉芽组织的沉积、细胞浸润及再上皮化，而不仅是组织的收缩。VEGF可以调节一氧化氮来改善血管内皮的功能，促进胶原在糖尿病伤口沉积，且恢复正常的组织氧合及神经传导功能。VEGF用于治疗糖尿病伤口是通过促进血管趋化及生成而发挥作用的。近来的研究证实，VEGF能够刺激生成胶原蛋白及上皮形成[15]。VEGF伤口的治疗中可以通过多种途径发挥作用，在对糖尿病血管疾病的治疗中可以单独使用或与其他方法联合使用。
3VEGF基因治疗
慢性难愈创面的形成及发展与多种因素有关，其中内源性生长因子的严重匮乏是造成创面难以愈合的一个重要原因。皮肤组织适合进行基因治疗，极易被转染，且转染基因能被检测，还能祛除转染的各类细胞。因此，难愈行创面可以采用外源性基因治疗。
3.1直接注入法使用蛋白直接注入治疗法，其操作技术的简便，作用直接、起效较快，这是临床主要的方法。注入途径或方法：肌内、静脉滴注、皮内、皮下、动静脉内、筋膜下注射等。但VEGF蛋白易变性，水解后变成单体，失去活性，只有6min半衰期，且价格昂贵，单次大量应用还会引起血流动力学的障碍，所以，在注入途径或给药方式上出现较大的局限性[24]。裸DNA直接注射不具有体外转染细胞，但其体内原位注射时细胞的转染率非常高，且在皮下及肌肉的用药方式上，具体机制还不明确。另外，还具有稳定性及靶向性较差的缺点。微粒轰击技术是借组于基因枪产生的高速度将微粒攻入靶细胞，将目的DNA在该离子的参与下吸附微粒（通常是金粒）。优点是便于操作、具有可重复性、转染率高；缺点是仪器设备昂贵，DNA穿透度浅且携带量低。微种植技术，是使用更新的文身机驱动的多个显微操作针在细胞膜上随机地多重穿孔，最后再把DNA注入细胞内。这项技术操作简单、转染率较，且不能形成压力波，但仪器费用非常高，转染持续时间太短。此外还有超声微泡造影剂法和电穿孔方法等[25]。
3.2基因导入疗法基因疗法是指将基因引入到靶细胞，要使用一个载体能包装基因且转移基因。载体便于基因进入靶细胞而且确保基因进入靶细胞后基因转录而且能够保护基因在进入细胞前后不被降解。载体应具有以下特征：足够大以便治疗基因的插入，能较容易地以单一形式高产量生产，没有炎性反应、细胞毒性反应和免疫应答高效且稳定地转导非再育细胞。
3.2.1病毒载体以病毒载体来介导进行基因转移的优点是具有良好的靶向性。但在理论上会发生复制型病毒、免疫毒性及癌变等安全性的问题。腺病毒载体的优点主要是不要求严格的细胞分裂形式，导人效率高，无需长时间的筛选，很少被整合入人类基因组，被裂解后并不引起亚型的改变。缺点主要是载体产生免疫会产生毒性反应，甚者引起细胞死亡[26]。逆转录病毒载体的优点是可以广泛地感染细胞，能稳定整合人宿主细胞，使其基因持久表达，免疫反应低，基因容量较大。缺点是可能引起宿主基因突变，随机整合，只能感染分裂细胞[27]。腺伴随病毒载体含有LacZ基因，优点是无致病风险、免疫原性低、能感染非分裂及分裂的细胞，不会引起癌变及突变。缺点是复制及包装需要配合病毒（如腺病毒）以及包裹能力不超过4.5kb[28]。慢病毒载体的优点是能感染非分裂和分裂的细胞，因外源基因能持久表达，因此，能稳定整合人宿主染色体。最新的研究发现，慢病毒与逆转录病毒比较对生长抑制细胞的转染效率是逆转录的10余倍，且更能抵抗体内沉默。缺点是存在毒力恢复及垂直感染等风险，不过，新的研究发现了慢病毒载体系统有关该问题的克服因素[29]。
3.2.2非病毒载体非病毒载体技术因其具有非免疫性及易生产性的特点而倍受关注。但其存在转染效率及靶向性低的问题。
脂质体转基因技术是利用双层分子脂质体，在带负电荷及静电作用的DNA分子的作用下形成复合体，再通过胞吞作用进入细胞。该技术的优点是操作简单、病毒相对安全。缺点是脂质体与DNA的计量比会影响到治疗结果，且脂质体对细胞能产生毒性[30]。纳米微囊技术，是用纳米微囊作为基因转运载体，把DNA和RNA等基因治疗分子吸附在其表面，或包裹在纳米颗粒中，同时通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，可以在颗粒表面耦联特异性的靶向分子，在胞吞作用下进入细胞内，起到有效的靶向性治疗。它可使基因不被核酸酶降解，具有特异性，其表面耦联特异性的靶向分子，基因可以缓慢释放，并保持一定的浓度，能持久地产生作用，提高转染产物的转染率及生物利甩度；代谢产物少、副作用小且不会发生免疫排斥反应等[31-32]。但目前很多特殊性能的纳米微囊在制备上要作到有关问题亟待解决。 4问题与展望
目前，在基因治疗方面仍存在基因转染载体时的转染效率及风险控制问题。理论上，基因治疗后VEGF表达促进未发现的小肿瘤终末期生长的可能性是存在的，但至今在进行基因治疗的患者汇中，还没有发生这样的风险。有关VEGF基因治疗的远期安全性还有待于进一步步的研究来证实。在基因治疗中促进VEGF的表达，可以有效地治疗缺血性疾病。由于VEGF在组织血管的修复及再生中有积极的促进作用，因此，在创面的愈合、组织再生及加速移植物血管化等方面有望有较好的应用前景。随着上述问题的不断解决及进一步的深入研究，VEGF转基因治疗必将在今后临床治疗中发挥越来越重要的作用。
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【关键词】难愈创面；血管内皮生长因子
难愈创面是指由于各种致伤因素所导致的未能按预期愈合的创面组织，此种现象多发生在接受细胞毒性药物治疗、激素治疗、大面积烧伤、糖尿病及心血管疾病的患者中，在临床治疗方面始终是个难题。难愈创面愈合需要多种细胞及组织来参与，其过程主要包括细胞增殖、转移、炎性改变及重塑创面等环节[1]。
有研究发现，细胞生长因子在创面愈合的整个过程中发挥着非常重要的作用，包括分化、趋化、增殖，最终使创面愈合。血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是血管的生成中最强的调控因素，在新生血管的生成中起着极其重要的作用[2]，它能为新生血管的生成提供营养物质、组织需氧及生物活性物质，进而促进创面愈合。VEGF作用于血管内皮细胞促使血管内皮的迁移及增殖，能够促使心血管的形成，为创面提供血液，促进创面的愈合。本文中笔者对难愈创面治疗中血管内皮生长因子的研究现状进行综述研究。
1VEGF的生物学功能
主要功能：①延长内皮细胞寿命：并促进内皮细胞的增殖和繁殖的能力，降低细胞的蜕变及凋亡[3]。在细胞外VEGF能促进内皮细胞分化、迁移及生长，在细胞内能促进血管生成；VEGF还能短暂地激活细胞上的磷脂酶C、诱导Ca2+离子直接作用于内皮细胞，促进内皮细胞增殖。②增强血管的通透性：VEGF通过促进前列环素和血管内皮细胞NO的合成来增强血管的通透性[4]。VEGF结合Flt1发挥增强血管通透性的效果要比组胺的作用强5万多倍，且其作用短暂、快速，不会发生肥大细胞的颗粒的减少，也不受抗组胺药物的影响。③促进血管生成：VEGF可以升高内皮细胞的钙浓度，使其在短时间内升高、分裂及变性，加速降解基底膜，调控内皮细胞的基因表达，促进血管的重构，还能促进内皮细胞合成大量的蛋白水解酶，通过上述作用促进血管的生成[9]。④血管维持功能：VEGF是主要的内皮细胞调节器，通过调节血管内皮细胞NO，来维持血管的正常状态及功能[5]。⑤VEGF能诱导单核细胞化学迁移及趋化，调控单核细胞，发挥止血的作用；参与间质液引流，还能选择性地促使淋巴管增生[7]。
VEGF通过促进内皮细胞增生、迁移等作用，而促进血管形成，同时，在动静脉的分化中也起着关键的作用。动静脉分化是通过VEGFR2下的两条相互竞争的信号途径（活化磷脂酶C-γ及丝裂原活化蛋白激酶（MAPK）途径）来实现，通过这两个途径能激活转录因子，直接激化Delta样配体4（Dll4），诱导动脉标记物Dll4和Notch1表达。而丝氨酸苏氨酸蛋白激酶（PI3K-AKT）/磷脂酰肌醇3激酶能对上述信号进行抑制，促使血管向静脉分化[8-9]。
VEGF能促进血管内皮细胞的迁移、增生，同时还能阻止内皮细胞的凋亡。有实验证实，对特发性肺纤维化大鼠转染VEGF后，肺部血管增加了血管化，减少了内皮细胞的凋亡，并能改善肺动脉高压[10]。VEGF造成血管的去稳定和血管成熟障碍，导致负性作用表现为抑制周细胞在新生出芽血管的覆盖[11]。
2VEGF在难愈创面中的作用机理
2.1VEGF在大面积烧伤创面中的作用机理血管生成在烧伤创面愈合中起着关键的作用。VEGF能促进血管形成，是作用于血管内皮细的多功能、特异性因子，它通过促进血管内皮细胞的迁移、增殖、改变细胞外基质成分、增强血管通透性等多种途径发挥作用。对烧伤患者的研究发现，烧伤后损伤到血管，可促进释放VEGF，使内皮前体细胞从骨髓中快速释放到血液，同时血浆中的VEGF水平也快速升高。血管损伤后血浆内的VEGF一般在伤后的6-12小时达到峰值，48-72小时后会逐渐下降，这与烧伤患者休克期体液渗出的生理病理机制具有一致性[20]。研究健康者和烧伤患者血清中的VEGF浓度显示，烧伤后发生肿胀，血浆中的VEGF水平快速增高，直至消肿后下降，因此，VEGF与严重烧伤患者的体液渗出肿胀关系密切。烧伤后的皮肤组织在缺血、缺氧的环境中促使了VEGF mRNA的表达，通过旁分泌来升高了VEGF受体的水平，进而升高了患者血液中的VEGF，VEGF对烧伤创面有促进愈合的作用。Infanger等[21]表明，烧伤病人在伤后的l-3周内VEGF水平明显升高，在伤后的14d达到一定的峰值，与最初的烧伤严重程度关系不大，而与伤后并发症情况有一定的关系。烧伤部位在修复早期因为组织缺氧，且不同组织是含氧量不同，造成伤处的血管再生进度也不相同，VEGF是再生的主要调节因素。在创伤早期的缺氧阶段，VEGF的水平明显增高，随着新生血管的增多及伤口的不断愈合VEGF水平逐渐降低[22]。在VEGF的作用下，内皮细胞增生，能加快创面炎症反应的进程，快速地清除坏死组织，使修复细胞趋向创面，促进伤口创面的愈合。对烧伤大鼠使用腺病毒当作载体转导VEGF进行治疗，可促进创面上皮细胞血管的生成，证实了VEGF基因转导可以有效地治疗高热损伤[23]。
2.2VEGF在静脉瘀血性溃疡中的作用机理下肢静脉瘀血性溃疡是一种血管源性、退行性、慢性进行性病变，主要病变是下肢静脉高压、静脉血液倒流、静脉血液郁滞。下肢长期淤血，降低了组织的含氧量，增高了血管壁的通透性，部分组织因缺血、缺氧，营养不足，发生纤维化，色素沉着，出现营养不良及免疫功力低下，如果发生损伤，会造成局部出现瘀血性皮炎和溃疡，使伤口很难愈合[17]。当发生静脉溃疡时，该组织缺氧，应激性地升高了VEGF在该部位的组织及血浆中的水平，但是，VEGF在溃疡处的功能状态及其与受体的作用机理临床上尚未研究清楚。Kusumanto等[18]对9例休息痛周围动脉炎和/或缺血溃疡患者进行了肌肉内转基因VEGF治疗，结果发现，9例患者的病情较治疗前有所好转，但发生了短暂性的下肢水肿。 2.3VEGF在缺血心脏病中的作用机理VEGF可以用来治疗冠状动脉缺血性心脏病，VEGF质粒编码直接注射进入患者的心肌可以为心绞痛治疗无效果而改善冠脉血管症状[19]。有研究发现，VEGF在治疗相关性心血管疾病中有较好的临床疗效。对缺血性心肌梗死患者，在心脏梗死区外源性给予VEGF，能提高梗死区的VEGF生成浓度，能促进血管的再生，改善侧支循环血流及心肌的供血。VEGF在血管成形术及手术中得到了有效地管理，并作为辅助治疗措施。另外，VEGF还能增强冠脉血管的通透性、舒张冠脉。有研究发现，使用VEGF抑制抗体有可能诱发深静脉血栓及心脑血管血栓，这提示内源性VEGF可能在成人脉管系统中起到保护作用。
2.4VEGF在糖尿病性创面中的作用机理糖尿病患者发生创伤后创面一般很难愈合，这是临床治疗中的非常棘手的问题。糖尿病患者皮肤组织发生损伤后，引起局部经皮血流量和氧分压（TcPO2）降低。Brem等[13]研究了转基因糖尿病小鼠模型发现，在没有发生损伤的情况下，VEGFmRNA在其皮肤组织中具有高表达。Hortreed等[12]报道，非胰岛素依赖性糖尿病患者肌肉内毛细血管密度明显降低。因此，在皮肤组织发生创伤后，创面周围的VEGF表达水平在初期明显增加，之后逐渐下降，在损伤5天后已经无法检测到VEGF。因此，在正常皮肤组织中VEGF的表达水平较高，而在糖尿病患者伴有皮肤创伤时，动物实验显示，几种合成生长因子的水平降低了，其中主要包括VEGF[14]。在非胰岛素依赖的血糖尿病小鼠模型中，VEGF及蛋白表达降低，抑制了新血管的形成。
糖尿病伤口在愈合的过程中同样要依赖肉芽组织的沉积、细胞浸润及再上皮化，而不仅是组织的收缩。VEGF可以调节一氧化氮来改善血管内皮的功能，促进胶原在糖尿病伤口沉积，且恢复正常的组织氧合及神经传导功能。VEGF用于治疗糖尿病伤口是通过促进血管趋化及生成而发挥作用的。近来的研究证实，VEGF能够刺激生成胶原蛋白及上皮形成[15]。VEGF伤口的治疗中可以通过多种途径发挥作用，在对糖尿病血管疾病的治疗中可以单独使用或与其他方法联合使用。
3VEGF基因治疗
慢性难愈创面的形成及发展与多种因素有关，其中内源性生长因子的严重匮乏是造成创面难以愈合的一个重要原因。皮肤组织适合进行基因治疗，极易被转染，且转染基因能被检测，还能祛除转染的各类细胞。因此，难愈行创面可以采用外源性基因治疗。
3.1直接注入法使用蛋白直接注入治疗法，其操作技术的简便，作用直接、起效较快，这是临床主要的方法。注入途径或方法：肌内、静脉滴注、皮内、皮下、动静脉内、筋膜下注射等。但VEGF蛋白易变性，水解后变成单体，失去活性，只有6min半衰期，且价格昂贵，单次大量应用还会引起血流动力学的障碍，所以，在注入途径或给药方式上出现较大的局限性[24]。裸DNA直接注射不具有体外转染细胞，但其体内原位注射时细胞的转染率非常高，且在皮下及肌肉的用药方式上，具体机制还不明确。另外，还具有稳定性及靶向性较差的缺点。微粒轰击技术是借组于基因枪产生的高速度将微粒攻入靶细胞，将目的DNA在该离子的参与下吸附微粒（通常是金粒）。优点是便于操作、具有可重复性、转染率高；缺点是仪器设备昂贵，DNA穿透度浅且携带量低。微种植技术，是使用更新的文身机驱动的多个显微操作针在细胞膜上随机地多重穿孔，最后再把DNA注入细胞内。这项技术操作简单、转染率较，且不能形成压力波，但仪器费用非常高，转染持续时间太短。此外还有超声微泡造影剂法和电穿孔方法等[25]。
3.2基因导入疗法基因疗法是指将基因引入到靶细胞，要使用一个载体能包装基因且转移基因。载体便于基因进入靶细胞而且确保基因进入靶细胞后基因转录而且能够保护基因在进入细胞前后不被降解。载体应具有以下特征：足够大以便治疗基因的插入，能较容易地以单一形式高产量生产，没有炎性反应、细胞毒性反应和免疫应答高效且稳定地转导非再育细胞。
3.2.1病毒载体以病毒载体来介导进行基因转移的优点是具有良好的靶向性。但在理论上会发生复制型病毒、免疫毒性及癌变等安全性的问题。腺病毒载体的优点主要是不要求严格的细胞分裂形式，导人效率高，无需长时间的筛选，很少被整合入人类基因组，被裂解后并不引起亚型的改变。缺点主要是载体产生免疫会产生毒性反应，甚者引起细胞死亡[26]。逆转录病毒载体的优点是可以广泛地感染细胞，能稳定整合人宿主细胞，使其基因持久表达，免疫反应低，基因容量较大。缺点是可能引起宿主基因突变，随机整合，只能感染分裂细胞[27]。腺伴随病毒载体含有LacZ基因，优点是无致病风险、免疫原性低、能感染非分裂及分裂的细胞，不会引起癌变及突变。缺点是复制及包装需要配合病毒（如腺病毒）以及包裹能力不超过4.5kb[28]。慢病毒载体的优点是能感染非分裂和分裂的细胞，因外源基因能持久表达，因此，能稳定整合人宿主染色体。最新的研究发现，慢病毒与逆转录病毒比较对生长抑制细胞的转染效率是逆转录的10余倍，且更能抵抗体内沉默。缺点是存在毒力恢复及垂直感染等风险，不过，新的研究发现了慢病毒载体系统有关该问题的克服因素[29]。
3.2.2非病毒载体非病毒载体技术因其具有非免疫性及易生产性的特点而倍受关注。但其存在转染效率及靶向性低的问题。
脂质体转基因技术是利用双层分子脂质体，在带负电荷及静电作用的DNA分子的作用下形成复合体，再通过胞吞作用进入细胞。该技术的优点是操作简单、病毒相对安全。缺点是脂质体与DNA的计量比会影响到治疗结果，且脂质体对细胞能产生毒性[30]。纳米微囊技术，是用纳米微囊作为基因转运载体，把DNA和RNA等基因治疗分子吸附在其表面，或包裹在纳米颗粒中，同时通过靶向分子与细胞表面特异性受体结合，可以在颗粒表面耦联特异性的靶向分子，在胞吞作用下进入细胞内，起到有效的靶向性治疗。它可使基因不被核酸酶降解，具有特异性，其表面耦联特异性的靶向分子，基因可以缓慢释放，并保持一定的浓度，能持久地产生作用，提高转染产物的转染率及生物利甩度；代谢产物少、副作用小且不会发生免疫排斥反应等[31-32]。但目前很多特殊性能的纳米微囊在制备上要作到有关问题亟待解决。 4问题与展望
目前，在基因治疗方面仍存在基因转染载体时的转染效率及风险控制问题。理论上，基因治疗后VEGF表达促进未发现的小肿瘤终末期生长的可能性是存在的，但至今在进行基因治疗的患者汇中，还没有发生这样的风险。有关VEGF基因治疗的远期安全性还有待于进一步步的研究来证实。在基因治疗中促进VEGF的表达，可以有效地治疗缺血性疾病。由于VEGF在组织血管的修复及再生中有积极的促进作用，因此，在创面的愈合、组织再生及加速移植物血管化等方面有望有较好的应用前景。随着上述问题的不断解决及进一步的深入研究，VEGF转基因治疗必将在今后临床治疗中发挥越来越重要的作用。
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