【摘 要】
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目的 研究比格犬雌激素受体β(Estrogen receptor β,ERβ)及其剪接异构体在生殖调控中的功能,构建比格犬ERβ的pMAL-p5x/ERβ 480 DE3 E.coli重组菌株,并进行纯化和鉴定.方
【机 构】
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军事医学科学院实验动物中心,北京100071;兰州军区乌鲁木齐总医院动物实验科,乌鲁木齐830000;军事医学科学院实验动物中心,北京,100071;吉林大学畜牧兽医学院,长春130062
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目的 研究比格犬雌激素受体β(Estrogen receptor β,ERβ)及其剪接异构体在生殖调控中的功能,构建比格犬ERβ的pMAL-p5x/ERβ 480 DE3 E.coli重组菌株,并进行纯化和鉴定.方法 Trizol法提取发情期比格犬下丘脑总RNA,RT-PCR获得cDNA,以NCBI网站公布的比格犬ERβ基因CDS序列设计特异性引物,扩增ERβ保守区基因编码序列(16-496 bp),连接原核表达载体pMAL-p5x,筛选、鉴定阳性克隆并测序.将重组质粒转化至大肠杆菌DH5α,再转化大肠杆菌BL21(DE3),用IPTG诱导表达,表达产物经经麦芽糖亲和树脂(Amylom Resin)亲和层析分离纯化,并对纯化的融合蛋白进行鉴定.结果 构建了pMAL-p5x/ER(a)480重组质粒,在DE3大肠杆菌中诱导表达出MBP-ERβ融合蛋白,SDS-PAGE显示分子量约为60 000,与预期结果一致；优化了MBP-ERβ表达体系的表达条件:分别在0.2％葡萄糖,100 μg/ml Ampcillin,0.1mmol/L IPTG 37℃培养5h或在0.2％葡萄糖,50 μg/ml Ampcillin,0.2mmol/L IPTG 37℃培养3h,融合蛋白表达效果比较好.结论 构建了pMAL-p5x/ERβ480原核表达重组质粒,获得了比格犬MBP-ERβ融合蛋白,为犬种属特异性ERβ多克隆抗体的制备及功能分析奠定了基础.
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