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[摘要]目的：通过对自体移植皮片中黑素细胞密度和功能变化的测定，进一步认识黑素细胞密度变化在自体移植皮片过度色素沉着中的作用。方法：利用免疫组织化学方法测定自体中厚移植皮片黑素细胞中特异性抗原显示黑素细胞，计算表皮中黑素细胞的密度，并与自体正常皮肤对照；利用银染－丽春红法检测自体中厚移植皮片和正常皮肤中黑素含量。结果：自体移植皮片与自体对照正常皮肤中黑素细胞的密度差异无显著性(P＞0.05)；自体中厚移植皮片中黑色素含量较自体正常对照皮肤中的黑色素含量明显增多，差异有统计学意义(P＜0.01)。结论：自体皮片移植后表皮中黑素细胞密度无明显变化，与皮片色素沉着程度无显著相关性。
[关键词]自体移植皮片；黑素细胞；过度色素沉着
[中图分类号]R622 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)06－0731－03
自体皮片移植是整形外科常用的手术方法之一，但皮片移植成活后常伴有不同程度的过度色素沉着。国内外许多学者对皮片移植后过度色素沉着的机制作了研究，其中对于皮片移植后黑素细胞数量的变化有着不同的看法。本实验通过测定人体自体中厚移植皮片中黑素细胞的密度变化，以及自体中厚移植皮片中黑素含量的变化，进一步澄清黑素细胞密度的变化在自体移植皮片过度色素沉着中的作用。
1 材料和方法
1．1 实验标本：本组实验所需标本均取自颈部自体中厚皮片移植术后1年，局部需再次手术的患者。取自体中厚移植皮片23例，同时在每例移植皮片受区及原供区腹部周围分别切取正常皮肤作对照。患者年龄7～34岁，男16例，女7例。所取标本的患者均无垂体肾上腺疾病、传染病、皮肤病及免疫性疾病，局部无感染、溃疡，术前未应用激素及免疫抑制剂治疗，局部亦未曾行放射治疗。标本切取后在半小时内放入液氮瓶，然后置－80℃冰箱保存。1．2主要试剂：Mel－5单克隆抗体：美国SignetLaboratories Inc产品；Envision免疫组化染色试剂盒：美国Dako公司；DAB：美国Sigma公司等；Fontana银液；氯化金；丽春红(Ponceau)(上海天平化学试剂厂)；JVC彩色摄像头(TK－C1381，JVC公司，日本)；彩色病理图像分析系统(四川大学图像图形研究所)。
1．3 免疫组化步骤：切片脱蜡至水，每张切片加过氧化酶阻断剂(3％H2O2)50μl，作用10min，以阻断内源性过氧化物酶活性；切片浸入0.01mol/L PBS缓冲液中，微波处理10min：每张切片加鼠抗人Mel－5单克隆抗体50μl，37℃条件，作用60min：每张切片加Envision试剂50μl，37℃条件，作用30min；以上各步骤均经0.01mol/L PBS(pH7.4)冲洗，5min×3次；然后将切片置新鲜配制的0.01％DAB/0.03％H202显色液中显色，蒸馏水冲洗，苏木素复染1min；脱水，透明，中性树胶封片。同时用PBS代替Mel－5单克隆抗体作阴性对照。
1．4 Masson Fontana－Poneeau染色：各组标本石蜡包埋后，切片脱蜡至蒸馏水浸洗，再浸入Fontana银液15h；蒸馏水及时浸洗2次，氯化金处理2min：蒸馏水浸洗2次，Ponceau处理3min：无水乙醇脱水，过滤纸吸干；二甲苯透明和中性树胶封闭；镜检，黑色素定位于表皮黑素细胞、角朊细胞胞浆。胶原纤维呈红色，背景淡黄色；拍照，扫描成像分析仪处理系统进行光密度扫描。
1．5 统计学处理：实验数据以x±s表示，组间比较用t检验，使用SPSS10.0统计软件包处理，P＜0.01为有统计学意义。
2 结果
2．1 免疫组化染色结果：Mel－5免疫标记物定位于基底部黑素细胞胞浆，为黄或棕黄色颗粒，呈局灶性或弥漫性分布(图1)。各组标本中每200个基底细胞中平均阳性细胞数为：自体中厚移植皮片组28.4±3.2；皮片原供区正常皮肤组26.8±4.5；皮片受区周围正常皮肤组27.6±4.1。自体中厚移植皮片组中黑素细胞密度与皮片原供区和受区周围正常皮肤中黑素细胞密度相比，其差异性不显著(P＞0.05)；皮片受区周围正常对照皮肤与原供区腹部正常对照皮肤中黑素细胞密度的差异亦无显著性(P＞0.05)
2．2 Masson Fontana－Ponceau染色结果：黑色素呈黑色，定位于表皮黑素细胞、角朊细胞胞浆，胶原纤维呈红色，背景呈淡黄色。在白体中厚移植皮片表皮基底细胞中黑素含量较皮片原供区和受区周围正常皮肤中明显增多；皮片表皮基底层黑素细胞中黑素小体明显增多，在突起未端亦见黑素小体增多，与黑素细胞相邻近的角朊细胞中黑素颗粒明显增多且位于角朊细胞细胞核的上方，在棘层和颗粒层细胞中可见少许黑素颗粒(图2)，经计算机扫描计算各组灰度值为：自体中厚移植皮片组为0.73±0.07；皮片原供区正常皮肤组为0.24±0.03；皮片受区周围正常皮肤组为0.29±0.06。自体中厚移植皮片组中黑素含量与皮片原供区和受区周围正常皮肤中黑素含量相比，差异有统计学意义(P＜0.01)；皮片受区周围正常对照皮肤与原供区腹部正常对照皮肤中黑素含量相比差异无统计学意义(P＞0.05)
3 讨论
自体皮片移植是整形外科常用的手术方法之一，但移植皮片成活后常伴有不同程度的过度色素沉着，从而影响了手术效果。如何防治自体皮片移植后过度色素沉着，至今仍是困扰整形外科医生的一道难题，主要原因是其确切发生机制尚未阐明。
对于自体皮片移植后呈过度色素沉着现象许多学者作了研究，提出了许多重要的理论，但在自体皮片移植后表皮中黑素细胞的密度变化在皮片过度色素沉着中的作用，存在不同的看法。此前亦有研究表明，黑素细胞来源于胚胎时期的神经嵴细胞，分化程度高，通过有丝分裂增殖的可能性较小，不同种族的人正常皮肤中黑素细胞数大体上是相同的，但黑种人角朊细胞内黑素体数量多、形大、黑素化程度深，单个散在分布、降解缓慢。而来自白种人则相反，黑素体量少、形小、黑素化程度轻，多聚集分布于吞噬溶酶小体内，容易发生降解，这些表现及过程与遗传因素有关，并受多种基因的调控。但亦有人又观察到在皮肤慢性炎症或损伤后，处于炎性环璄中的黑素细胞可发生有丝分裂进行增殖，并可发生黑素细胞的移行。
为观察自体中厚移植皮片在经历了组织损伤、修复，炎性反应基本稳定后，其表皮黑素细胞的密度变化与皮片呈过度色素沉着表现是否具有相关性，本研究利用75KDa的色素相关糖原蛋白特异性存在于表皮黑素细胞中参与黑素的合成，通过免疫组化方法使用特异性的单克隆抗体Mel－5与表皮黑素细胞中75KDa的色素相关糖原蛋白抗原相结合，显示黑素细胞；结果表明，黑素细胞密度变化在自体中厚移植皮片与正常对照皮肤之间无显著差异，供区与受区部位正常对照皮肤之间黑素细胞数量的差异亦无显著差异性，说明白体皮片移植后虽经历了组织的损伤、修复及炎性反应过程，黑素细胞的密度无明显变化。同时利用银染一丽春红法检测自体中厚移植皮片和正常皮肤中黑素含量，显示在自体中厚移植皮片表皮中黑素含量较正常皮肤中明显增多，从大体上亦观察到皮片呈过度色素沉着表现。从细胞形态学上观察亦可知，自体皮片移植后表皮中黑素细胞分支状树突增多，与周围基底细胞连接紧密；角朊细胞亦表现为胞体肥大，核淡染，核周出现透明区，与黑素细胞连接紧密，表明白体皮片移植后表皮中黑素细胞、角朊细胞的结构特征发生了变化，相应细胞的功能亦可能会发生变化。至于本实验观察到皮片表皮中黑素细胞密度变化与李海洋等观察的结果不一致，也许是两者观察的时间差异所致，本组实验所取标本均为术后一年，移植皮片的组织损伤、修复及炎性反应基本稳定，而后者的观察时间是术后三月内，移植皮片的组织损伤、修复及炎症反应可能还未完全消退，表皮黑素细胞还处于从损伤到恢复、增殖的过程中，其后续变化情况可进一步研究观察。
在此前研究中我们观察到自体中厚移植皮片a－MSH及其受体的表达明显增强，在自体移植皮片过度色素沉着过程中起重要调控作用。研究表明a－MSH及其受体的表达上调通过G蛋白与腺甘酸环化酶偶联增加细胞内cAMP含量，蛋白激酶被激活，酪氨酸酶生成增多，活性增强，黑素合成增加并使黑素体扩散，且主要是优先刺激合成优黑素并促进黑素体扩散，在黑素细胞、角朊细胞内呈“核上帽”形成分布，从而使皮肤的色素沉着明显。由上可知，自体移植皮片在经历组织的损伤、修复及炎症反应过程后，其表皮中黑素细胞功能增强、表皮中黑素含量明显增多，是导致皮片呈过度色素沉着表现的主要原因，其基底层黑素细胞的密度无明显变化，故自体皮片移植后呈过度色素沉着表现与黑素细胞的密度变化无明显相关性。
[关键词]自体移植皮片；黑素细胞；过度色素沉着
[中图分类号]R622 [文献标识码]A [文章编号]1008－6455(2007)06－0731－03
自体皮片移植是整形外科常用的手术方法之一，但皮片移植成活后常伴有不同程度的过度色素沉着。国内外许多学者对皮片移植后过度色素沉着的机制作了研究，其中对于皮片移植后黑素细胞数量的变化有着不同的看法。本实验通过测定人体自体中厚移植皮片中黑素细胞的密度变化，以及自体中厚移植皮片中黑素含量的变化，进一步澄清黑素细胞密度的变化在自体移植皮片过度色素沉着中的作用。
1 材料和方法
1．1 实验标本：本组实验所需标本均取自颈部自体中厚皮片移植术后1年，局部需再次手术的患者。取自体中厚移植皮片23例，同时在每例移植皮片受区及原供区腹部周围分别切取正常皮肤作对照。患者年龄7～34岁，男16例，女7例。所取标本的患者均无垂体肾上腺疾病、传染病、皮肤病及免疫性疾病，局部无感染、溃疡，术前未应用激素及免疫抑制剂治疗，局部亦未曾行放射治疗。标本切取后在半小时内放入液氮瓶，然后置－80℃冰箱保存。1．2主要试剂：Mel－5单克隆抗体：美国SignetLaboratories Inc产品；Envision免疫组化染色试剂盒：美国Dako公司；DAB：美国Sigma公司等；Fontana银液；氯化金；丽春红(Ponceau)(上海天平化学试剂厂)；JVC彩色摄像头(TK－C1381，JVC公司，日本)；彩色病理图像分析系统(四川大学图像图形研究所)。
1．3 免疫组化步骤：切片脱蜡至水，每张切片加过氧化酶阻断剂(3％H2O2)50μl，作用10min，以阻断内源性过氧化物酶活性；切片浸入0.01mol/L PBS缓冲液中，微波处理10min：每张切片加鼠抗人Mel－5单克隆抗体50μl，37℃条件，作用60min：每张切片加Envision试剂50μl，37℃条件，作用30min；以上各步骤均经0.01mol/L PBS(pH7.4)冲洗，5min×3次；然后将切片置新鲜配制的0.01％DAB/0.03％H202显色液中显色，蒸馏水冲洗，苏木素复染1min；脱水，透明，中性树胶封片。同时用PBS代替Mel－5单克隆抗体作阴性对照。
1．4 Masson Fontana－Poneeau染色：各组标本石蜡包埋后，切片脱蜡至蒸馏水浸洗，再浸入Fontana银液15h；蒸馏水及时浸洗2次，氯化金处理2min：蒸馏水浸洗2次，Ponceau处理3min：无水乙醇脱水，过滤纸吸干；二甲苯透明和中性树胶封闭；镜检，黑色素定位于表皮黑素细胞、角朊细胞胞浆。胶原纤维呈红色，背景淡黄色；拍照，扫描成像分析仪处理系统进行光密度扫描。
1．5 统计学处理：实验数据以x±s表示，组间比较用t检验，使用SPSS10.0统计软件包处理，P＜0.01为有统计学意义。
2 结果
2．1 免疫组化染色结果：Mel－5免疫标记物定位于基底部黑素细胞胞浆，为黄或棕黄色颗粒，呈局灶性或弥漫性分布(图1)。各组标本中每200个基底细胞中平均阳性细胞数为：自体中厚移植皮片组28.4±3.2；皮片原供区正常皮肤组26.8±4.5；皮片受区周围正常皮肤组27.6±4.1。自体中厚移植皮片组中黑素细胞密度与皮片原供区和受区周围正常皮肤中黑素细胞密度相比，其差异性不显著(P＞0.05)；皮片受区周围正常对照皮肤与原供区腹部正常对照皮肤中黑素细胞密度的差异亦无显著性(P＞0.05)
2．2 Masson Fontana－Ponceau染色结果：黑色素呈黑色，定位于表皮黑素细胞、角朊细胞胞浆，胶原纤维呈红色，背景呈淡黄色。在白体中厚移植皮片表皮基底细胞中黑素含量较皮片原供区和受区周围正常皮肤中明显增多；皮片表皮基底层黑素细胞中黑素小体明显增多，在突起未端亦见黑素小体增多，与黑素细胞相邻近的角朊细胞中黑素颗粒明显增多且位于角朊细胞细胞核的上方，在棘层和颗粒层细胞中可见少许黑素颗粒(图2)，经计算机扫描计算各组灰度值为：自体中厚移植皮片组为0.73±0.07；皮片原供区正常皮肤组为0.24±0.03；皮片受区周围正常皮肤组为0.29±0.06。自体中厚移植皮片组中黑素含量与皮片原供区和受区周围正常皮肤中黑素含量相比，差异有统计学意义(P＜0.01)；皮片受区周围正常对照皮肤与原供区腹部正常对照皮肤中黑素含量相比差异无统计学意义(P＞0.05)
3 讨论
自体皮片移植是整形外科常用的手术方法之一，但移植皮片成活后常伴有不同程度的过度色素沉着，从而影响了手术效果。如何防治自体皮片移植后过度色素沉着，至今仍是困扰整形外科医生的一道难题，主要原因是其确切发生机制尚未阐明。
对于自体皮片移植后呈过度色素沉着现象许多学者作了研究，提出了许多重要的理论，但在自体皮片移植后表皮中黑素细胞的密度变化在皮片过度色素沉着中的作用，存在不同的看法。此前亦有研究表明，黑素细胞来源于胚胎时期的神经嵴细胞，分化程度高，通过有丝分裂增殖的可能性较小，不同种族的人正常皮肤中黑素细胞数大体上是相同的，但黑种人角朊细胞内黑素体数量多、形大、黑素化程度深，单个散在分布、降解缓慢。而来自白种人则相反，黑素体量少、形小、黑素化程度轻，多聚集分布于吞噬溶酶小体内，容易发生降解，这些表现及过程与遗传因素有关，并受多种基因的调控。但亦有人又观察到在皮肤慢性炎症或损伤后，处于炎性环璄中的黑素细胞可发生有丝分裂进行增殖，并可发生黑素细胞的移行。
为观察自体中厚移植皮片在经历了组织损伤、修复，炎性反应基本稳定后，其表皮黑素细胞的密度变化与皮片呈过度色素沉着表现是否具有相关性，本研究利用75KDa的色素相关糖原蛋白特异性存在于表皮黑素细胞中参与黑素的合成，通过免疫组化方法使用特异性的单克隆抗体Mel－5与表皮黑素细胞中75KDa的色素相关糖原蛋白抗原相结合，显示黑素细胞；结果表明，黑素细胞密度变化在自体中厚移植皮片与正常对照皮肤之间无显著差异，供区与受区部位正常对照皮肤之间黑素细胞数量的差异亦无显著差异性，说明白体皮片移植后虽经历了组织的损伤、修复及炎性反应过程，黑素细胞的密度无明显变化。同时利用银染一丽春红法检测自体中厚移植皮片和正常皮肤中黑素含量，显示在自体中厚移植皮片表皮中黑素含量较正常皮肤中明显增多，从大体上亦观察到皮片呈过度色素沉着表现。从细胞形态学上观察亦可知，自体皮片移植后表皮中黑素细胞分支状树突增多，与周围基底细胞连接紧密；角朊细胞亦表现为胞体肥大，核淡染，核周出现透明区，与黑素细胞连接紧密，表明白体皮片移植后表皮中黑素细胞、角朊细胞的结构特征发生了变化，相应细胞的功能亦可能会发生变化。至于本实验观察到皮片表皮中黑素细胞密度变化与李海洋等观察的结果不一致，也许是两者观察的时间差异所致，本组实验所取标本均为术后一年，移植皮片的组织损伤、修复及炎性反应基本稳定，而后者的观察时间是术后三月内，移植皮片的组织损伤、修复及炎症反应可能还未完全消退，表皮黑素细胞还处于从损伤到恢复、增殖的过程中，其后续变化情况可进一步研究观察。
在此前研究中我们观察到自体中厚移植皮片a－MSH及其受体的表达明显增强，在自体移植皮片过度色素沉着过程中起重要调控作用。研究表明a－MSH及其受体的表达上调通过G蛋白与腺甘酸环化酶偶联增加细胞内cAMP含量，蛋白激酶被激活，酪氨酸酶生成增多，活性增强，黑素合成增加并使黑素体扩散，且主要是优先刺激合成优黑素并促进黑素体扩散，在黑素细胞、角朊细胞内呈“核上帽”形成分布，从而使皮肤的色素沉着明显。由上可知，自体移植皮片在经历组织的损伤、修复及炎症反应过程后，其表皮中黑素细胞功能增强、表皮中黑素含量明显增多，是导致皮片呈过度色素沉着表现的主要原因，其基底层黑素细胞的密度无明显变化，故自体皮片移植后呈过度色素沉着表现与黑素细胞的密度变化无明显相关性。