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摘要：目的：本实验利用选择性培养基BCP从酸菜中筛选一株高产γ-氨基丁酸菌株。方法：对其形态学及生理生化实验进行鉴定，利用高效液相色谱法（HPLC）测定发酵液GABA产量，并对该菌株进行紫外及亚硝基胍（NTG）诱变，结果：确定该菌株为噬酸乳杆菌，编号为SW-135，发酵液中GABA为0.57克/升，诱变最佳条件为：紫外照射距离20厘米，时间60秒；NTG浓度为0.3克/升，处理时间20分钟，结论：诱变后得到高产突变菌株SW-135-13，连续传代5次，未见回复突变，平均GABA产量为1.31克/升。
关键词：噬酸乳杆菌；γ-氨基丁酸；诱变
中图分类号：TQ921.3文献标识码：A文章编号：1674-0432（2014）-05-28-3
0引言
γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是天然存在的一种非蛋白质组成氨基酸，白色结晶状，易潮解，极易溶于水[1]。它具有特殊的生理活性，在动植物体内均能发现它的存在。在豆类、中草药种子中都含有较多的GABA[2]。在动物体内，它主要存在于神经组织中，科学研究表明[3]，它具有较多的生理功能，它能促进脑的活化，美容润肤，改善睡眠，健脑益智，减慢脑衰老机能，高效减肥，抗惊厥，降低血压、血氨等功能，同时，还能抑制多种疾病的发生，比如脂肪肝、肾炎等[4]。
GABA的制备有生物合成法和化学合成法[5]。化学合成法要求反应条件比较苛刻，成本高，得率低。生物合成法相比较来说既安全、成本又低。目前主要采用曲霉菌、酵母、乳酸菌来发酵谷氨酸产GABA，由于菌种缺乏安全性，因此找到一株高产可食用的菌种产GABA，势在必行[6]。
本实验从酸菜、泡菜、酸奶中筛选出一株产GABA菌株，为了提高其产GABA含量，对其进行紫外及亚硝基胍诱变，进一步提高其产量，为今后的研究打下了基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1材料东北地产自然发酵的酸菜、泡菜，均购自长春市农贸市场；老北京酸奶，购自长春市佳得乐超市。
1.1.2仪器与设备CL-32L型全自动高压灭菌锅，日本ALP公司；SHP-250型生化培养箱，上海精宏实验仪器有限公司；XS-402型电子显微镜，南京江南光电集团股份有限公司；SW-CJ-1FD超净工作台，苏州净化设备有限公司。
1.1.3培养基MRS液体培养基（L）：蛋白胨10.0克，牛肉膏10.0克，酵母浸粉5.0克，磷酸二氢钾2.0克，柠檬酸三铵2.0克，乙酸钠5.0克，葡萄糖20.0克，吐温801.0毫升，MgSO4·7H2O 0.5克， MnSO4·4H2O 0.25克，调pH至6.2～6.4，121℃灭菌20分钟。
MRS固体培养基：MRS液体培养基基础上添加琼脂15～20克，121℃灭菌20分钟。用于保藏菌种。
乳酸菌分离培养基（BCP）：酵母粉0.5克，乳糖0.5克，5%溴甲酚紫0.25毫升，水100毫升，pH自然。
BCP固体培养基：在液体培养基基础上添加琼脂20克。
1.1.4试剂γ-氨基丁酸，磷酸吡哆醛，亚硝基胍北京鼎国；其他试剂均为国产分析纯。
1.2实验方法
1.2.1目的菌株的筛选分别取酸菜汁、泡菜汁、酸奶稀释适当的倍数，取0.2毫升稀释液无菌涂布于BCP平板上，35℃静置培养48小时。
挑选周围变黄的可疑菌落，采用平板划线法，反复纯化，直到得到纯菌株。
1.2.2γ-氨基丁酸测定方法
1.2.2.1采用薄层层析法定性测定发酵液中GABA含量[7]
展开剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶2∶1，显色剂为0.6%茚三酮溶液，以5∶2比例加入层析缸内，取出（5×10）厘米硅胶板，点取3毫克/毫升GABA标准品和预处理的发酵液，完毕后置于80℃烘箱内，显色10分钟。
1.2.2.2利用高效液相色譜法定量测定发酵液中GABA含量[8]
取出发酵液，离心15分钟（8000转/分钟），弃沉淀，将上清液浓缩至10毫升，供HPLC分析。以GABA浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.3菌种形态学及生理生化鉴定观察平板上菌落形态，挑取单菌落进行革兰氏染色，在100倍油镜下观察单菌株形态。然后进行微生物生理生化实验，淀粉水解实验、石蕊牛乳试验、硫化氢实验、明胶液化实验、葡萄糖产酸产气实验。
1.2.4微生物生长曲线将斜面保存菌种，以5%接种量接入100毫升MRS液体培养基中，35℃培养24小时，实验中每隔2小时取一次菌液，以未接菌培养的培养基做对照，在波长600毫米处测定其吸光值。绘制菌体生长曲线图。
1.2.5菌株的诱变
1.2.5.1紫外诱变[9]取发酵菌液20毫升置于空培养皿中，放到距离25W紫外灯20厘米处，再打开磁力搅拌器，分别诱变5秒、15秒、25秒、30秒、35秒、45秒、60秒。取各个诱变菌液1毫升分别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，然后分别吸取诱变菌液0.2毫升涂布于BCP平板上，同时，以未诱变菌种作对照。35℃培养48小时，计算诱变菌种的致死率。
1.2.5.2亚硝基胍（NTG）诱变[10]取菌悬液20毫升离心15分钟（8000r/分钟），弃上清液，用灭菌的生理盐水洗涤一次沉淀，再加入20毫升灭菌生理盐水，震荡均匀。以10毫克NTG：1毫升丙酮的体积比配制亚硝基胍诱变溶液，再以0.3克/升亚硝基胍诱变液加入到菌液中，35℃、90转/秒分别处理20分钟、30分钟、40分钟、50分钟，然后计算致死率，确定处理时间。
在确定处理时间基础上，在分别将0.1克/升、0.2克/升、0.3克/升、0.4克/升、0.5克/升的亚硝基胍诱变液加入到菌悬液中，处理一定时间，计算致死率，确定处理剂量。 1.2.5.3致死率的计算
计算公式如下：
2.3菌株的生长曲线
菌株的生长曲线图如图3，图3表明，菌株的对数生长期为2～12小时。
2.4菌株的诱变
2.4.1紫外诱变时间的确定紫外诱变时间与SW-135致死率关系如图4。根据文献报道[12]，一般把致死率在80%～90%的范围作为紫外诱变最佳时间，此时容易筛选到高产正突变株。图4表明，当菌液稀释到10～3时，紫外照射60秒，致死率为85.5%。因此，本实验选取最佳诱变时间为60秒。
2.4.2亚硝基胍诱变剂量的确定如图5所示，随着亚硝基胍处理时间的增加，致死率也不断的增加，当处理时间为30分钟时，致死率为86.2%，因此，选择最佳处理时间为30分钟。但是致死率还与亚硝基胍浓度有关系，在确定了最佳处理时间的基础上，进一步考查了亚硝基胍浓度与致死率的关系。如图6所示，当其浓度为0.3克/升时，致死率为87.1%。因此本实验选择亚硝基胍浓度为0.3克/升。
2.4.3菌株的遗传稳定性将突变菌株进行传代培养，用高效液相发检测发酵液中γ-氨基丁酸含量[13]，突变菌株遗传稳定，未见回复突变，菌株产γ-氨基丁酸高达1.35克/升，较诱变前菌株提高了0.78克/升。
3讨论
本实验从酸菜、泡菜、酸奶中筛选出5株产菌株，经过复筛得到一株高产的噬酸乳桿菌，命名为SW-135，其产量为0.57克/升，并以SW-135为出发菌株进行紫外和亚硝基胍诱变，研究发现紫外诱变最佳时间为60秒；亚硝基胍诱变最佳浓度0.3克/升时处理时间30分钟。经过诱变和筛选，得到高产突变菌株SW-135-13，产量为1.35克/升，是出发菌株2.37倍[14]。
参考文献
[1]赵玉红，张立钢，庞伟娜.乳酸菌和酵母菌共生发酵面包的研究[J].食品工业技术，2003，24 （3）：61-62.
[2]吴祖兴.乳酸菌在发酵香肠中的应用研究[J].食品工业科技，2002，23（8）：55-57.
[3]李志成，严佩峰，李红蕊，等.乳酸菌基础培养基比较研究[J].食品研究与开发，2007，23 （11）：68-75.
[4]刘屹峰.乳酸菌的生理特性和生物学功能[J].丹东纺专学报，2002，16 （2）：36-44.
[5]谈重芳，王雁萍，霍裕平，等.乳酸菌鉴定方法在食品工业中的应用及研究进展[J].食品工业科技，2007，（2）：76-85.
[6]赵斌，何绍江.微生物实验[M].北京：科学出版社，2004.
[7]徐成勇，郭本恒，吴昊.酸奶发酵剂和乳酸菌生物技术育种[J] .中国生物工程杂志，2004，（7）：55-59.
[8]栾金水.乳酸菌的研究应用进展[J].江苏调味副食品， 2004，21（1）：8-10.
[9]黄君红，成洁珊，陈青荷.乳酸菌生长最佳培养基的筛选[J].中国酿造，2001，（2）：9-11.
[10]徐冬云，周立平，童振宇，等.产γ-氨基丁酸乳酸菌的分离筛选[J].现代食品科技，2006，22（3）：59-64.
[11] Guin TWC，Bottiglieri TSI.GABA，γ-hydroxybutyric acid， and neurological disease [J].Ann Neurol，2003，6：3-12.
[12] Xiao -feng Guo， Hitoshi. Identification of highγ-Aminobutyric Acid producing Marine Yeast Strains by Physiological and Biochemical Characteristics and Gene sequence Analyses [J]. Biosci. Biotechonol. Biochem.，2009，73（7），1527-1534.
[13]李玉萍，熊向源，叶军等.γ-氨基丁酸在开发功能性食品中的应用[J].河北农业科学，2008，12（11）：52-54，69.
[14]叶砚，蒋冬花，嵇豪.响应面法优化红曲X27液态发酵产γ-氨基丁酸工艺条件[J].中国粮油学报，2010，25（9）.
作者简介：黄翠萍，吉林农业大学食品科学与工程学院，硕士研究生，研究方向：微生物菌种筛选及发酵条件优化。
通讯作者：郑鸿雁，硕士，副教授，研究方向：功能食品、微生物菌种筛选及发酵工艺研究。
关键词：噬酸乳杆菌；γ-氨基丁酸；诱变
中图分类号：TQ921.3文献标识码：A文章编号：1674-0432（2014）-05-28-3
0引言
γ-氨基丁酸（γ-aminobutyric acid，GABA）是天然存在的一种非蛋白质组成氨基酸，白色结晶状，易潮解，极易溶于水[1]。它具有特殊的生理活性，在动植物体内均能发现它的存在。在豆类、中草药种子中都含有较多的GABA[2]。在动物体内，它主要存在于神经组织中，科学研究表明[3]，它具有较多的生理功能，它能促进脑的活化，美容润肤，改善睡眠，健脑益智，减慢脑衰老机能，高效减肥，抗惊厥，降低血压、血氨等功能，同时，还能抑制多种疾病的发生，比如脂肪肝、肾炎等[4]。
GABA的制备有生物合成法和化学合成法[5]。化学合成法要求反应条件比较苛刻，成本高，得率低。生物合成法相比较来说既安全、成本又低。目前主要采用曲霉菌、酵母、乳酸菌来发酵谷氨酸产GABA，由于菌种缺乏安全性，因此找到一株高产可食用的菌种产GABA，势在必行[6]。
本实验从酸菜、泡菜、酸奶中筛选出一株产GABA菌株，为了提高其产GABA含量，对其进行紫外及亚硝基胍诱变，进一步提高其产量，为今后的研究打下了基础。
1材料与方法
1.1材料与试剂
1.1.1材料东北地产自然发酵的酸菜、泡菜，均购自长春市农贸市场；老北京酸奶，购自长春市佳得乐超市。
1.1.2仪器与设备CL-32L型全自动高压灭菌锅，日本ALP公司；SHP-250型生化培养箱，上海精宏实验仪器有限公司；XS-402型电子显微镜，南京江南光电集团股份有限公司；SW-CJ-1FD超净工作台，苏州净化设备有限公司。
1.1.3培养基MRS液体培养基（L）：蛋白胨10.0克，牛肉膏10.0克，酵母浸粉5.0克，磷酸二氢钾2.0克，柠檬酸三铵2.0克，乙酸钠5.0克，葡萄糖20.0克，吐温801.0毫升，MgSO4·7H2O 0.5克， MnSO4·4H2O 0.25克，调pH至6.2～6.4，121℃灭菌20分钟。
MRS固体培养基：MRS液体培养基基础上添加琼脂15～20克，121℃灭菌20分钟。用于保藏菌种。
乳酸菌分离培养基（BCP）：酵母粉0.5克，乳糖0.5克，5%溴甲酚紫0.25毫升，水100毫升，pH自然。
BCP固体培养基：在液体培养基基础上添加琼脂20克。
1.1.4试剂γ-氨基丁酸，磷酸吡哆醛，亚硝基胍北京鼎国；其他试剂均为国产分析纯。
1.2实验方法
1.2.1目的菌株的筛选分别取酸菜汁、泡菜汁、酸奶稀释适当的倍数，取0.2毫升稀释液无菌涂布于BCP平板上，35℃静置培养48小时。
挑选周围变黄的可疑菌落，采用平板划线法，反复纯化，直到得到纯菌株。
1.2.2γ-氨基丁酸测定方法
1.2.2.1采用薄层层析法定性测定发酵液中GABA含量[7]
展开剂为正丁醇∶冰醋酸∶水=4∶2∶1，显色剂为0.6%茚三酮溶液，以5∶2比例加入层析缸内，取出（5×10）厘米硅胶板，点取3毫克/毫升GABA标准品和预处理的发酵液，完毕后置于80℃烘箱内，显色10分钟。
1.2.2.2利用高效液相色譜法定量测定发酵液中GABA含量[8]
取出发酵液，离心15分钟（8000转/分钟），弃沉淀，将上清液浓缩至10毫升，供HPLC分析。以GABA浓度为横坐标，峰面积为纵坐标绘制标准曲线。
1.2.3菌种形态学及生理生化鉴定观察平板上菌落形态，挑取单菌落进行革兰氏染色，在100倍油镜下观察单菌株形态。然后进行微生物生理生化实验，淀粉水解实验、石蕊牛乳试验、硫化氢实验、明胶液化实验、葡萄糖产酸产气实验。
1.2.4微生物生长曲线将斜面保存菌种，以5%接种量接入100毫升MRS液体培养基中，35℃培养24小时，实验中每隔2小时取一次菌液，以未接菌培养的培养基做对照，在波长600毫米处测定其吸光值。绘制菌体生长曲线图。
1.2.5菌株的诱变
1.2.5.1紫外诱变[9]取发酵菌液20毫升置于空培养皿中，放到距离25W紫外灯20厘米处，再打开磁力搅拌器，分别诱变5秒、15秒、25秒、30秒、35秒、45秒、60秒。取各个诱变菌液1毫升分别稀释10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6，然后分别吸取诱变菌液0.2毫升涂布于BCP平板上，同时，以未诱变菌种作对照。35℃培养48小时，计算诱变菌种的致死率。
1.2.5.2亚硝基胍（NTG）诱变[10]取菌悬液20毫升离心15分钟（8000r/分钟），弃上清液，用灭菌的生理盐水洗涤一次沉淀，再加入20毫升灭菌生理盐水，震荡均匀。以10毫克NTG：1毫升丙酮的体积比配制亚硝基胍诱变溶液，再以0.3克/升亚硝基胍诱变液加入到菌液中，35℃、90转/秒分别处理20分钟、30分钟、40分钟、50分钟，然后计算致死率，确定处理时间。
在确定处理时间基础上，在分别将0.1克/升、0.2克/升、0.3克/升、0.4克/升、0.5克/升的亚硝基胍诱变液加入到菌悬液中，处理一定时间，计算致死率，确定处理剂量。 1.2.5.3致死率的计算
计算公式如下：
2.3菌株的生长曲线
菌株的生长曲线图如图3，图3表明，菌株的对数生长期为2～12小时。
2.4菌株的诱变
2.4.1紫外诱变时间的确定紫外诱变时间与SW-135致死率关系如图4。根据文献报道[12]，一般把致死率在80%～90%的范围作为紫外诱变最佳时间，此时容易筛选到高产正突变株。图4表明，当菌液稀释到10～3时，紫外照射60秒，致死率为85.5%。因此，本实验选取最佳诱变时间为60秒。
2.4.2亚硝基胍诱变剂量的确定如图5所示，随着亚硝基胍处理时间的增加，致死率也不断的增加，当处理时间为30分钟时，致死率为86.2%，因此，选择最佳处理时间为30分钟。但是致死率还与亚硝基胍浓度有关系，在确定了最佳处理时间的基础上，进一步考查了亚硝基胍浓度与致死率的关系。如图6所示，当其浓度为0.3克/升时，致死率为87.1%。因此本实验选择亚硝基胍浓度为0.3克/升。
2.4.3菌株的遗传稳定性将突变菌株进行传代培养，用高效液相发检测发酵液中γ-氨基丁酸含量[13]，突变菌株遗传稳定，未见回复突变，菌株产γ-氨基丁酸高达1.35克/升，较诱变前菌株提高了0.78克/升。
3讨论
本实验从酸菜、泡菜、酸奶中筛选出5株产菌株，经过复筛得到一株高产的噬酸乳桿菌，命名为SW-135，其产量为0.57克/升，并以SW-135为出发菌株进行紫外和亚硝基胍诱变，研究发现紫外诱变最佳时间为60秒；亚硝基胍诱变最佳浓度0.3克/升时处理时间30分钟。经过诱变和筛选，得到高产突变菌株SW-135-13，产量为1.35克/升，是出发菌株2.37倍[14]。
参考文献
[1]赵玉红，张立钢，庞伟娜.乳酸菌和酵母菌共生发酵面包的研究[J].食品工业技术，2003，24 （3）：61-62.
[2]吴祖兴.乳酸菌在发酵香肠中的应用研究[J].食品工业科技，2002，23（8）：55-57.
[3]李志成，严佩峰，李红蕊，等.乳酸菌基础培养基比较研究[J].食品研究与开发，2007，23 （11）：68-75.
[4]刘屹峰.乳酸菌的生理特性和生物学功能[J].丹东纺专学报，2002，16 （2）：36-44.
[5]谈重芳，王雁萍，霍裕平，等.乳酸菌鉴定方法在食品工业中的应用及研究进展[J].食品工业科技，2007，（2）：76-85.
[6]赵斌，何绍江.微生物实验[M].北京：科学出版社，2004.
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[9]黄君红，成洁珊，陈青荷.乳酸菌生长最佳培养基的筛选[J].中国酿造，2001，（2）：9-11.
[10]徐冬云，周立平，童振宇，等.产γ-氨基丁酸乳酸菌的分离筛选[J].现代食品科技，2006，22（3）：59-64.
[11] Guin TWC，Bottiglieri TSI.GABA，γ-hydroxybutyric acid， and neurological disease [J].Ann Neurol，2003，6：3-12.
[12] Xiao -feng Guo， Hitoshi. Identification of highγ-Aminobutyric Acid producing Marine Yeast Strains by Physiological and Biochemical Characteristics and Gene sequence Analyses [J]. Biosci. Biotechonol. Biochem.，2009，73（7），1527-1534.
[13]李玉萍，熊向源，叶军等.γ-氨基丁酸在开发功能性食品中的应用[J].河北农业科学，2008，12（11）：52-54，69.
[14]叶砚，蒋冬花，嵇豪.响应面法优化红曲X27液态发酵产γ-氨基丁酸工艺条件[J].中国粮油学报，2010，25（9）.
作者简介：黄翠萍，吉林农业大学食品科学与工程学院，硕士研究生，研究方向：微生物菌种筛选及发酵条件优化。
通讯作者：郑鸿雁，硕士，副教授，研究方向：功能食品、微生物菌种筛选及发酵工艺研究。