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摘要：WRKY转录因子家族普遍存在于植物体内，对植物的多种生理过程有广泛的调控作用，在众多植物转录因子家族中占有重要地位。本研究从茶树中克隆获得一个WRKY基因，命名为CsWRKY3，该基因包含一个1 710 bp的开放读码框，编码569个氨基酸。qRT-PCR结果显示，CsWRKY3在茶树根、叶、花中的表达水平较高，在茎、种子中的表达水平较低。当茶树叶片受到机械损伤或者被茶尺蠖幼虫取食时，CsWRKY3基因被迅速诱导且表达差异显著。本研究表明CsWRKY3转录因子基因参与了茶树的抗虫防御反应。
关键词：WRKY转录因子；茶树；茶尺蠖；机械损伤；抗虫防御
中圖分类号：S571.1：Q785文献标识号：A文章编号：1001-4942（2018）01-0001-08
Abstract WRKY transcription factor family exists widely in plants and has a wide range of regulation effects for a variety of physiological processes in plants， and occupys a very important position in plant transcription factor family. In this study， a WRKY gene， designated as CsWRKY3， was cloned from tea plants， and the open reading frame of CsWRKY3 was 1 710 bp， which encoded 569 amino acids. The results of real-time PCR showed that CsWRKY3 was highly expressed in roots， leaves and flowers， but was weakly expressed in stems and seeds. CsWRKY3 was quickly induced and expressed significantly when the leaves of tea plant were damaged by mechanical damage or eaten by the Ectropis obliqua larvae. This study showed that the CsWRKY3 was involved in defense response against insect pests of tea.
Keywords WRKY transcription factor； Camellia sinensis； Ectropis obliqua； Mechanical damage； Defense against insect pests
WRKY是一类仅存在于高等植物中的转录因子[1]。WRKY转录因子具有两个重要特征：第一，至少有一个WRKY结构域，该结构域含有约60个氨基酸残基，且具有WRKYGQK等7个保守序列；第二，在保守序列后含有一段锌指结构。根据所含WRKY结构域数目和锌指结构序列的不同，可将WRKY转录因子分成三类。含有两个WRKY结构域且具有C2H2型锌指结构的为第Ⅰ类；含有一个WRKY结构域且具有C2H2型锌指结构的为第Ⅱ类；含有一个WRKY结构域且具有C2HC型锌指结构的为第Ⅲ类[2]。
自1994年Ishiguro等第一次在甘薯中发现该转录因子的存在[3]、1996年Rushton等第一次在欧芹中将此转录因子命名为WRKY后[4]，研究人员围绕WRKY做了更深入的研究。研究表明，WRKY转录因子依靠自身的WRKY结构域与靶标基因的W-box特异性结合，进而实现对下游基因的调控作用[5]。大量的试验证明，WRKY转录因子参与植物生长和发育的过程，其不仅可以调节植物种子的发育及萌发、影响植物茎秆的生长速度[6]，还对植物衰老的延缓或促进有一定的调节作用[7]。进一步的研究显示，WRKY转录因子的存在与植物抵抗非生物胁迫息息相关[8]。如：水稻（Oryza sativa）含有的OsWRKY11对干旱和高温胁迫有相应的抵抗作用[9]；OsWRKY47可以调控下游基因的表达提高水稻抵抗干旱的能力[10]；GmWRKY27的存在可以提高大豆（Glycine max）的抗旱性和抗盐性[11]。除此之外，WRKY转录因子还可以调控植物体对病虫害的抵抗能力[12]。当受到植食性昆虫的为害后，植物体内WRKY转录因子表达水平会发生相应的变化[13]；CmWRKY48在菊花（Chrysanthemum morifolium）防御蚜虫为害中起到重要作用，过量表达可以抑制蚜虫群体的增长[14]；水稻OsWRKY89基因的过表达可增强水稻对白背飞虱（Sogatella furcifera）的抗性[15]，OsWRKY53和OsWRKY70基因可以通过调节水稻体内茉莉酸（jasmonic acid， JA）、乙烯（ethylene， ET）、水杨酸（salicylic acid， SA）和过氧化氢（H2O2）的合成来调节水稻对二化螟（Chilo suppressalis）、褐飞虱（Nilaparvata lugens）的抗性[16]。
茶树（Camellia sinensis）是一种重要的多年生经济作物，主要种植于亚洲、非洲、拉丁美洲和大洋洲。茶叶中含有丰富的茶多酚等对人体有益的化合物，可有效预防恶性肿瘤的发生，降低心脑血管疾病和神经系统疾病的出现概率[17]。由于生长环境高温潮湿，茶树经常受到茶尺蠖（Ectropis obliqua Prout）等害虫的为害导致减产，严重时甚至绝产[18]。虽然WRKY转录因子的研究已经相当全面且深入，但是茶树上WRKY转录因子的研究仅局限在WRKY结构分类[19]或其对于高温等非生物胁迫的抗性方面[20]，鲜有WRKY转录因子参与茶树抗虫方面的报道。本研究基于茶树转录组数据克隆获得一个WRKY基因，命名为CsWRKY3，对其进行生物信息学分析，并研究茶尺蠖取食和机械损伤处理茶苗后CsWRKY3的相对表达水平，为研究CsWRKY3调控茶树抗虫性提供理论依据。 1 材料与方法
1.1 供试茶苗
以2年生龙井43号扦插苗为供试茶苗，培养于（26±2）℃、光周期12 L∶12 D、相对湿度60%～70%的温室中，根据茶苗发育情况，每季度施用有机肥一次。选择长势较齐整、叶层较平均、无病虫为害的茶苗用于试验。
1.2 供试昆虫
茶尺蠖蛹取自浙江省绍兴市御茶村茶业有限公司下辖茶园。室内区分雌雄后，分开饲养于温度（26±2）℃、光周期12 L∶12 D、相对湿度80%的RXZ智能型人工气候箱内，以幼嫩茶树叶片作为食物。成虫羽化并鉴定品种后，雌雄混养，待室内稳定驯养两代后，取第三代幼虫作为试验用虫。
1.3 茶苗处理及取样
1.3.1 茶苗不同组织、不同叶位样品取材 在温度（26±2）℃、相对湿度75%的温室中进行试验。选取生长状况相近的茶树，取根、茎、叶、花、种子五种组织器官，每种5组重复；另分别选取芽下第一、二、三、四叶，每叶位5组重复。取样后立刻投入液氮并转移至-80℃超低温冰箱保存。
1.3.2 茶尺蠖取食处理 在温度（26±2）℃、相对湿度75%的温室中进行试验。选择发育状况较均一的3龄茶尺蠖幼虫（TG）2头饥饿处理10 h后取食茶苗第二叶位，用规格为7 cm×5 cm的80目透明网袋套住被取食叶片，防止幼虫逃逸。对照组不做任何处理。待TG取食叶片有明显缺刻时开始计时，于0、1.5、3、6、12、24、48 h后取样，每个时间点5个重复，取样后立刻投入液氮并转移至-80℃超低温冰箱保存。
1.3.3 机械损伤处理 在温度（26±2）℃、相对湿度75%的温室中进行试验。用自制机械损伤处理器（用双面胶包裹10只昆虫针做成的末端平整的圆柱体）处理茶苗第二叶位，每片处理叶扎200次，对照组不做任何处理。于机械损伤0、0.5、1、2、4、8、12、24、48 h后取样，每个时间点5个重复，取样后立刻投入液氮并转移至-80℃超低温冰箱保存。
1.3.4 样品总RNA的提取和cDNA的合成 将所取试验样品用高通量研磨仪在液氮环境下进行研磨后，选用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒（天根生物科技有限公司）提取样品茶叶总RNA。提取到的RNA用Nanodrop ND2000（上海普元仪器有限公司）进行浓度检测，用PrimeScript RT reagent Kit（大连宝生物工程有限公司）进行反转录，所得cDNA放在-20℃冰箱内待用。
1.4 CsWRKY3基因的克隆
CsWRKY3序列来源于实验室茶树转录组数据，经ORF finder软件确定其具有完整的开放读码框。基于此，用Primer Premier 5.064设计序列全长引物（WRKY3-F：5′-CACCACCCACCACTCACA-3′；WRKY3-R：5′-AAAACCTTCATACCTCCT-3′），以反转录得到的cDNA为模板，对目的基因CsWRKY3进行扩增。扩增总反应体系为20 μL：PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12 μL、WRKY3-F和WRKY3-R各1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 5 μL。PCR扩增使用两步法，程序为：95℃预变性2 min；98℃变性10 s，65℃延伸1 min，30个循环；72℃终延伸5 min。扩增所得的PCR产物经电泳、凝胶回收、加多聚腺苷酸（PolyA）并纯化后，连接在pMD19-T载体上，连接成功后将质粒转化到E.coli DH5α Competent Cells感受态细胞，鉴定阳性克隆后，送南京金斯瑞士生物有限公司测序。
1.5 序列分析
测序所得核苷酸序列ORF的寻找以及同源性分析比对利用NCBI网站的ORF finder和BLAST工具完成。利用DNAMAN软件推测CsWRKY3基因编码的氨基酸序列。目的基因编码蛋白的等电点和分子量预测运用DNAStar软件进行。利用DNAMAN软件进行不同物种WRKY蛋白序列比对。使用MEGA5软件构建系统发育树。利用在线软件SWISS-MODEL进行蛋白质三维结构预测。
1.6 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
对反转录得到的cDNA进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）。选用SuperReal PreMix Plus （SYBR Green）作为荧光标记染料，以茶树GAPDH（GAPDHF： 5′ATACCACGTCACCTCGGT3′；GAPDHR：5′ACTTATGATGAAATCAAAGCTGC3′）为内部参照基因，以CsWRKY3qrtF： 5′CCCTTCACCTTGGAGATGTT3′； WRKY3qrtR：5′AGAGCTCCCAAATCCTGAGA3′为CsWRKY3实时荧光定量引物。反应总体系为20 μL：SYBR Green SuperReal PreMix Plus 10 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 7 μL。qRT-PCR反应程序：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，40个循环。每个样品设置5个生物学重复。
1.7 数据分析
试验数据通过PASW Statistics 18（Statistica，SAS，Institute，lnc.，Cary，NC，USA）軟件进行差异性分析。CsWRKY3在不同组织、不同叶位中的表达水平使用单因素方差分析法（ANOVA）进行比较，若差异显著（P<0.05），则使用Duncan’s法进一步分析。茶尺蠖幼虫取食、机械损伤两种不同处理下CsWRKY3转录因子基因的表达水平使用独立样本T-test进行比较。
2 结果与分析
2.1 茶树CsWRKY3基因的克隆 以茶尺蠖取食的茶树叶片为材料提取总RNA并反转录获取cDNA。经PCR 扩增，获得了大小约为2 000 bp 的特异性条带（图1），将克隆到的片段切胶回收连接克隆载体后测序，得到1 958 bp 的序列，与转录组数据的cDNA序列完全匹配。经ORF finder软件预测，CsWRKY3基因的开放阅读框（ORF）全长1 710 bp，编码含有569个氨基酸残基的蛋白质（图2）。预测该蛋白的分子量为62.98 kD，等电点为7.70。使用在线软件SWISS-MODEL对蛋白三维结构进行预测（图3），该蛋白结构与番茄（Solanum habrochaites）中的ShWRKY4蛋白结构极其相似[21]。
2.2 茶树CsWRKY3氨基酸序列比对
在NCBI中对CsWRKY3进行BLAST比对后，选取相似度高的10种植物的WRKY基因的氨基酸序列进行比对。结果显示，CsWRKY3与胡萝卜（Daucus carota，XM_017374603.1）、克莱门柚（Citrus clementina，XM_006431899.1）、陆地棉（Gossypium hirsutum，XM_016867635.1）、落花生（Arachis ipaensis，XM_016311067.1）、亚洲棉（Gossypium arboreum，XM_017783051.1）、葡萄（Vitis thunbergii，AM886166.1）、烟草（Nicotiana tabacum，AB022693.1）、大豆（Glycine max，NM_001317594.1）的WRKY蛋白均含有2个典型WRKY结构域和1个C2H2型锌指结构，属于WRKY家族中的第Ⅰ类；杨树（Populus trichocarpa， KR025520.1）、芝麻（Sesamum indicum，XM_011084080.2）的WRKY蛋白均含有1个典型WRKY结构域和1个C2H2型锌指结构，属于WRKY家族中的第Ⅱ类（图4）。
2.3 茶树CsWRKY3系统发育分析
选用MEGA5软件中邻接树算法对筛选出的与CsWRKY3序列相似度较高的10个不同物种的WRKY蛋白序列绘制系统发育树。结果显示，CsWRKY3与双子叶植物纲中的胡萝卜DcWRKY33、大豆GmWRKY25、落花生AiWRKY33进化关系较接近，与DcWRKY33的序列相似度达66.39%（图5）。
2.4 CsWRKY3在茶树不同组织、不同叶位中的表达分析
qRT-PCR数据分析显示，CsWRKY3在茶树根、茎、叶、花、种子等组织器官中均有表达，且在不同的组织器官中表达水平存在一定的差异（图6）。如图所示，茶树CsWRKY3基因在根中表达量最高，与茎、叶、花、种子之间存在显著性差异；CsWRKY3基因在叶、花中的表达量无显著差异，在茎、种子中的表达量也无显著差异，但在茎和种子中的表达量远低于在根、叶、花中的表达量。
如图7所示，CsWRKY3基因在不同叶位中的表达量存在明显差异，在发育相对成熟的第四叶位的表达量最高，且与第一、二、三叶位存在显著差异；CsWRKY3基因在第一、二、三叶位中的表达量没有显著差异。
2.5 机械损伤处理后CsWRKY3的表达分析
机械损伤处理茶树叶片不同时间后，CsWRKY3基因的相对表达水平在损伤0.5 h后迅速达到表达高峰，且与对照组存在极显著差异，这种显著性差异一直持续到叶片受损4 h；在0.5、1、2、4 h这四个时间点，CsWRKY3基因的相对表达水平分别是对照组的75.2、17.8、8.1、4.3倍；损伤48 h后，CsWRKY3基因的表达水平与对照无显著差异（图8）。
2.6 茶尺蠖取食后CsWRKY3的表达分析
qRT-PCR数据分析表明，茶尺蠖幼虫取食茶苗第二叶位1.5 h后，CsWRKY3被迅速诱导且差异极显著，表达水平是对照茶苗的11.9倍；TG取食3、12、24 h后茶树CsWRKY3基因的表达水平均有明显的上调，分别是对照的4.9、2.7、3.6倍；CsWRKY3基因的诱导呈现骤升缓降再升再降的趋势，于取食48 h后与对照没有显著差异（图9）。
3 讨论与结论
WRKY轉录因子家族普遍存在于植物体内，对植物的多种生理过程有广泛的调控作用，在众多植物转录因子家族中占有重要地位[22]。自1994年Ishiguro等在研究中首次发现WRKY转录因子的存在起，研究者分别对拟南芥[23]、番茄[24]、水稻[25]等多种植物中的WRKY转录因子做了深入研究。
本研究根据茶树转录组数据，通过RT-PCR技术获得一个茶树WRKY转录因子基因并命名为CsWRKY3，该基因ORF区域包含1 710个碱基，编码569个氨基酸，与其他植物WRKY基因具有较高相似性。氨基酸序列分析表明该基因编码蛋白含有2个特征性WRKY结构域和1个C2H2锌指结构，根据Eulgem等对WRKY的分类[2]，属于第Ⅰ类WRKY转录因子。
前人研究显示，WRKY基因的表达具有组织特异性，例如：LCWRKY5基因仅在山羊草的根和叶中有表达[26]，AtWRKY25主要表达于拟南芥的根中[27]。本研究结果显示，茶树CsWRKY3转录因子基因在茶树根、叶中相对表达量较高，在茎、种子中相对表达量较低，这与报道的马铃薯中StWRKY2基因在根和叶中的相对表达量显著高于其它组织相一致[28]，表明CsWRKY3的表达也具有组织特异性。依据文献研究规律，我们推测CsWRKY3在茶树叶片中的相对表达水平之所以较高，可能与茶树的防御反应有关[29]。WRKY基因具有诱导表达性，常见的是受到机械损伤的诱导，有报道显示罂粟植株在受到机械损伤后体内PsWRKY基因迅速被诱导[30]，烟草WRKY基因会在叶片受到机械损伤的情况下过量表达[31]，基于此，我们以机械损伤和茶尺蠖取食茶树叶片来验证该基因的功能。 Erb等[32]研究發现，植食性昆虫取食植物叶片会对叶面造成机械损伤，从而引起植物的抗性反应。本试验中，茶树叶片经过机械损伤处理和茶尺蠖幼虫取食处理后CsWRKY3被迅速激活，表达水平高于对照且差异显著，并且持续表达时间较长。Skibbe等[33]的研究结果显示，烟草受到烟草天蛾幼虫取食时，NaWRKY3和NaWRKY6会激发茉莉酸途径提高烟草的抗虫性，据此我们推测CsWRKY3可能通过茉莉酸途径参与茶树对茶尺蠖的防御作用。李冉[34]的研究表明，二化螟为害水稻后OsWRKY24和OsWRKY70转录因子可以直接调控JA合成途径的关键酶基因，或者通过调节其他转录因子间接调控JA合成酶基因。胡凌飞[16]的研究表明，二化螟和褐飞虱取食水稻时，OsWRKY53、OsWRKY70可以通过调控JA、ET和SA途径来抵抗虫害。这为我们下一步深入研究CsWRKY3参与的茶树抗虫作用机制提供了思路。
本试验首次在茶树中克隆到了CsWRKY3基因，并研究了该基因在不同组织器官中的表达差异性；通过分析该基因在机械损伤和茶尺蠖幼虫取食下的表达情况，推测CsWRKY3基因参与了茶树抵抗植食性昆虫为害的防御反应，这为后期研究CsWRKY3参与茶树抗虫反应的作用机制提供了研究基础。
参 考 文 献：
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Abstract WRKY transcription factor family exists widely in plants and has a wide range of regulation effects for a variety of physiological processes in plants， and occupys a very important position in plant transcription factor family. In this study， a WRKY gene， designated as CsWRKY3， was cloned from tea plants， and the open reading frame of CsWRKY3 was 1 710 bp， which encoded 569 amino acids. The results of real-time PCR showed that CsWRKY3 was highly expressed in roots， leaves and flowers， but was weakly expressed in stems and seeds. CsWRKY3 was quickly induced and expressed significantly when the leaves of tea plant were damaged by mechanical damage or eaten by the Ectropis obliqua larvae. This study showed that the CsWRKY3 was involved in defense response against insect pests of tea.
Keywords WRKY transcription factor； Camellia sinensis； Ectropis obliqua； Mechanical damage； Defense against insect pests
WRKY是一类仅存在于高等植物中的转录因子[1]。WRKY转录因子具有两个重要特征：第一，至少有一个WRKY结构域，该结构域含有约60个氨基酸残基，且具有WRKYGQK等7个保守序列；第二，在保守序列后含有一段锌指结构。根据所含WRKY结构域数目和锌指结构序列的不同，可将WRKY转录因子分成三类。含有两个WRKY结构域且具有C2H2型锌指结构的为第Ⅰ类；含有一个WRKY结构域且具有C2H2型锌指结构的为第Ⅱ类；含有一个WRKY结构域且具有C2HC型锌指结构的为第Ⅲ类[2]。
自1994年Ishiguro等第一次在甘薯中发现该转录因子的存在[3]、1996年Rushton等第一次在欧芹中将此转录因子命名为WRKY后[4]，研究人员围绕WRKY做了更深入的研究。研究表明，WRKY转录因子依靠自身的WRKY结构域与靶标基因的W-box特异性结合，进而实现对下游基因的调控作用[5]。大量的试验证明，WRKY转录因子参与植物生长和发育的过程，其不仅可以调节植物种子的发育及萌发、影响植物茎秆的生长速度[6]，还对植物衰老的延缓或促进有一定的调节作用[7]。进一步的研究显示，WRKY转录因子的存在与植物抵抗非生物胁迫息息相关[8]。如：水稻（Oryza sativa）含有的OsWRKY11对干旱和高温胁迫有相应的抵抗作用[9]；OsWRKY47可以调控下游基因的表达提高水稻抵抗干旱的能力[10]；GmWRKY27的存在可以提高大豆（Glycine max）的抗旱性和抗盐性[11]。除此之外，WRKY转录因子还可以调控植物体对病虫害的抵抗能力[12]。当受到植食性昆虫的为害后，植物体内WRKY转录因子表达水平会发生相应的变化[13]；CmWRKY48在菊花（Chrysanthemum morifolium）防御蚜虫为害中起到重要作用，过量表达可以抑制蚜虫群体的增长[14]；水稻OsWRKY89基因的过表达可增强水稻对白背飞虱（Sogatella furcifera）的抗性[15]，OsWRKY53和OsWRKY70基因可以通过调节水稻体内茉莉酸（jasmonic acid， JA）、乙烯（ethylene， ET）、水杨酸（salicylic acid， SA）和过氧化氢（H2O2）的合成来调节水稻对二化螟（Chilo suppressalis）、褐飞虱（Nilaparvata lugens）的抗性[16]。
茶树（Camellia sinensis）是一种重要的多年生经济作物，主要种植于亚洲、非洲、拉丁美洲和大洋洲。茶叶中含有丰富的茶多酚等对人体有益的化合物，可有效预防恶性肿瘤的发生，降低心脑血管疾病和神经系统疾病的出现概率[17]。由于生长环境高温潮湿，茶树经常受到茶尺蠖（Ectropis obliqua Prout）等害虫的为害导致减产，严重时甚至绝产[18]。虽然WRKY转录因子的研究已经相当全面且深入，但是茶树上WRKY转录因子的研究仅局限在WRKY结构分类[19]或其对于高温等非生物胁迫的抗性方面[20]，鲜有WRKY转录因子参与茶树抗虫方面的报道。本研究基于茶树转录组数据克隆获得一个WRKY基因，命名为CsWRKY3，对其进行生物信息学分析，并研究茶尺蠖取食和机械损伤处理茶苗后CsWRKY3的相对表达水平，为研究CsWRKY3调控茶树抗虫性提供理论依据。 1 材料与方法
1.1 供试茶苗
以2年生龙井43号扦插苗为供试茶苗，培养于（26±2）℃、光周期12 L∶12 D、相对湿度60%～70%的温室中，根据茶苗发育情况，每季度施用有机肥一次。选择长势较齐整、叶层较平均、无病虫为害的茶苗用于试验。
1.2 供试昆虫
茶尺蠖蛹取自浙江省绍兴市御茶村茶业有限公司下辖茶园。室内区分雌雄后，分开饲养于温度（26±2）℃、光周期12 L∶12 D、相对湿度80%的RXZ智能型人工气候箱内，以幼嫩茶树叶片作为食物。成虫羽化并鉴定品种后，雌雄混养，待室内稳定驯养两代后，取第三代幼虫作为试验用虫。
1.3 茶苗处理及取样
1.3.1 茶苗不同组织、不同叶位样品取材 在温度（26±2）℃、相对湿度75%的温室中进行试验。选取生长状况相近的茶树，取根、茎、叶、花、种子五种组织器官，每种5组重复；另分别选取芽下第一、二、三、四叶，每叶位5组重复。取样后立刻投入液氮并转移至-80℃超低温冰箱保存。
1.3.2 茶尺蠖取食处理 在温度（26±2）℃、相对湿度75%的温室中进行试验。选择发育状况较均一的3龄茶尺蠖幼虫（TG）2头饥饿处理10 h后取食茶苗第二叶位，用规格为7 cm×5 cm的80目透明网袋套住被取食叶片，防止幼虫逃逸。对照组不做任何处理。待TG取食叶片有明显缺刻时开始计时，于0、1.5、3、6、12、24、48 h后取样，每个时间点5个重复，取样后立刻投入液氮并转移至-80℃超低温冰箱保存。
1.3.3 机械损伤处理 在温度（26±2）℃、相对湿度75%的温室中进行试验。用自制机械损伤处理器（用双面胶包裹10只昆虫针做成的末端平整的圆柱体）处理茶苗第二叶位，每片处理叶扎200次，对照组不做任何处理。于机械损伤0、0.5、1、2、4、8、12、24、48 h后取样，每个时间点5个重复，取样后立刻投入液氮并转移至-80℃超低温冰箱保存。
1.3.4 样品总RNA的提取和cDNA的合成 将所取试验样品用高通量研磨仪在液氮环境下进行研磨后，选用RNAprep Pure植物总RNA提取试剂盒（天根生物科技有限公司）提取样品茶叶总RNA。提取到的RNA用Nanodrop ND2000（上海普元仪器有限公司）进行浓度检测，用PrimeScript RT reagent Kit（大连宝生物工程有限公司）进行反转录，所得cDNA放在-20℃冰箱内待用。
1.4 CsWRKY3基因的克隆
CsWRKY3序列来源于实验室茶树转录组数据，经ORF finder软件确定其具有完整的开放读码框。基于此，用Primer Premier 5.064设计序列全长引物（WRKY3-F：5′-CACCACCCACCACTCACA-3′；WRKY3-R：5′-AAAACCTTCATACCTCCT-3′），以反转录得到的cDNA为模板，对目的基因CsWRKY3进行扩增。扩增总反应体系为20 μL：PrimeSTAR Max DNA Polymerase 12 μL、WRKY3-F和WRKY3-R各1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 5 μL。PCR扩增使用两步法，程序为：95℃预变性2 min；98℃变性10 s，65℃延伸1 min，30个循环；72℃终延伸5 min。扩增所得的PCR产物经电泳、凝胶回收、加多聚腺苷酸（PolyA）并纯化后，连接在pMD19-T载体上，连接成功后将质粒转化到E.coli DH5α Competent Cells感受态细胞，鉴定阳性克隆后，送南京金斯瑞士生物有限公司测序。
1.5 序列分析
测序所得核苷酸序列ORF的寻找以及同源性分析比对利用NCBI网站的ORF finder和BLAST工具完成。利用DNAMAN软件推测CsWRKY3基因编码的氨基酸序列。目的基因编码蛋白的等电点和分子量预测运用DNAStar软件进行。利用DNAMAN软件进行不同物种WRKY蛋白序列比对。使用MEGA5软件构建系统发育树。利用在线软件SWISS-MODEL进行蛋白质三维结构预测。
1.6 实时荧光定量PCR（qRT-PCR）
对反转录得到的cDNA进行实时荧光定量PCR（qRT-PCR）。选用SuperReal PreMix Plus （SYBR Green）作为荧光标记染料，以茶树GAPDH（GAPDHF： 5′ATACCACGTCACCTCGGT3′；GAPDHR：5′ACTTATGATGAAATCAAAGCTGC3′）为内部参照基因，以CsWRKY3qrtF： 5′CCCTTCACCTTGGAGATGTT3′； WRKY3qrtR：5′AGAGCTCCCAAATCCTGAGA3′为CsWRKY3实时荧光定量引物。反应总体系为20 μL：SYBR Green SuperReal PreMix Plus 10 μL、上下游引物各1 μL、cDNA 1 μL、ddH2O 7 μL。qRT-PCR反应程序：95℃预变性30 s；95℃变性5 s，60℃退火30 s，40个循环。每个样品设置5个生物学重复。
1.7 数据分析
试验数据通过PASW Statistics 18（Statistica，SAS，Institute，lnc.，Cary，NC，USA）軟件进行差异性分析。CsWRKY3在不同组织、不同叶位中的表达水平使用单因素方差分析法（ANOVA）进行比较，若差异显著（P<0.05），则使用Duncan’s法进一步分析。茶尺蠖幼虫取食、机械损伤两种不同处理下CsWRKY3转录因子基因的表达水平使用独立样本T-test进行比较。
2 结果与分析
2.1 茶树CsWRKY3基因的克隆 以茶尺蠖取食的茶树叶片为材料提取总RNA并反转录获取cDNA。经PCR 扩增，获得了大小约为2 000 bp 的特异性条带（图1），将克隆到的片段切胶回收连接克隆载体后测序，得到1 958 bp 的序列，与转录组数据的cDNA序列完全匹配。经ORF finder软件预测，CsWRKY3基因的开放阅读框（ORF）全长1 710 bp，编码含有569个氨基酸残基的蛋白质（图2）。预测该蛋白的分子量为62.98 kD，等电点为7.70。使用在线软件SWISS-MODEL对蛋白三维结构进行预测（图3），该蛋白结构与番茄（Solanum habrochaites）中的ShWRKY4蛋白结构极其相似[21]。
2.2 茶树CsWRKY3氨基酸序列比对
在NCBI中对CsWRKY3进行BLAST比对后，选取相似度高的10种植物的WRKY基因的氨基酸序列进行比对。结果显示，CsWRKY3与胡萝卜（Daucus carota，XM_017374603.1）、克莱门柚（Citrus clementina，XM_006431899.1）、陆地棉（Gossypium hirsutum，XM_016867635.1）、落花生（Arachis ipaensis，XM_016311067.1）、亚洲棉（Gossypium arboreum，XM_017783051.1）、葡萄（Vitis thunbergii，AM886166.1）、烟草（Nicotiana tabacum，AB022693.1）、大豆（Glycine max，NM_001317594.1）的WRKY蛋白均含有2个典型WRKY结构域和1个C2H2型锌指结构，属于WRKY家族中的第Ⅰ类；杨树（Populus trichocarpa， KR025520.1）、芝麻（Sesamum indicum，XM_011084080.2）的WRKY蛋白均含有1个典型WRKY结构域和1个C2H2型锌指结构，属于WRKY家族中的第Ⅱ类（图4）。
2.3 茶树CsWRKY3系统发育分析
选用MEGA5软件中邻接树算法对筛选出的与CsWRKY3序列相似度较高的10个不同物种的WRKY蛋白序列绘制系统发育树。结果显示，CsWRKY3与双子叶植物纲中的胡萝卜DcWRKY33、大豆GmWRKY25、落花生AiWRKY33进化关系较接近，与DcWRKY33的序列相似度达66.39%（图5）。
2.4 CsWRKY3在茶树不同组织、不同叶位中的表达分析
qRT-PCR数据分析显示，CsWRKY3在茶树根、茎、叶、花、种子等组织器官中均有表达，且在不同的组织器官中表达水平存在一定的差异（图6）。如图所示，茶树CsWRKY3基因在根中表达量最高，与茎、叶、花、种子之间存在显著性差异；CsWRKY3基因在叶、花中的表达量无显著差异，在茎、种子中的表达量也无显著差异，但在茎和种子中的表达量远低于在根、叶、花中的表达量。
如图7所示，CsWRKY3基因在不同叶位中的表达量存在明显差异，在发育相对成熟的第四叶位的表达量最高，且与第一、二、三叶位存在显著差异；CsWRKY3基因在第一、二、三叶位中的表达量没有显著差异。
2.5 机械损伤处理后CsWRKY3的表达分析
机械损伤处理茶树叶片不同时间后，CsWRKY3基因的相对表达水平在损伤0.5 h后迅速达到表达高峰，且与对照组存在极显著差异，这种显著性差异一直持续到叶片受损4 h；在0.5、1、2、4 h这四个时间点，CsWRKY3基因的相对表达水平分别是对照组的75.2、17.8、8.1、4.3倍；损伤48 h后，CsWRKY3基因的表达水平与对照无显著差异（图8）。
2.6 茶尺蠖取食后CsWRKY3的表达分析
qRT-PCR数据分析表明，茶尺蠖幼虫取食茶苗第二叶位1.5 h后，CsWRKY3被迅速诱导且差异极显著，表达水平是对照茶苗的11.9倍；TG取食3、12、24 h后茶树CsWRKY3基因的表达水平均有明显的上调，分别是对照的4.9、2.7、3.6倍；CsWRKY3基因的诱导呈现骤升缓降再升再降的趋势，于取食48 h后与对照没有显著差异（图9）。
3 讨论与结论
WRKY轉录因子家族普遍存在于植物体内，对植物的多种生理过程有广泛的调控作用，在众多植物转录因子家族中占有重要地位[22]。自1994年Ishiguro等在研究中首次发现WRKY转录因子的存在起，研究者分别对拟南芥[23]、番茄[24]、水稻[25]等多种植物中的WRKY转录因子做了深入研究。
本研究根据茶树转录组数据，通过RT-PCR技术获得一个茶树WRKY转录因子基因并命名为CsWRKY3，该基因ORF区域包含1 710个碱基，编码569个氨基酸，与其他植物WRKY基因具有较高相似性。氨基酸序列分析表明该基因编码蛋白含有2个特征性WRKY结构域和1个C2H2锌指结构，根据Eulgem等对WRKY的分类[2]，属于第Ⅰ类WRKY转录因子。
前人研究显示，WRKY基因的表达具有组织特异性，例如：LCWRKY5基因仅在山羊草的根和叶中有表达[26]，AtWRKY25主要表达于拟南芥的根中[27]。本研究结果显示，茶树CsWRKY3转录因子基因在茶树根、叶中相对表达量较高，在茎、种子中相对表达量较低，这与报道的马铃薯中StWRKY2基因在根和叶中的相对表达量显著高于其它组织相一致[28]，表明CsWRKY3的表达也具有组织特异性。依据文献研究规律，我们推测CsWRKY3在茶树叶片中的相对表达水平之所以较高，可能与茶树的防御反应有关[29]。WRKY基因具有诱导表达性，常见的是受到机械损伤的诱导，有报道显示罂粟植株在受到机械损伤后体内PsWRKY基因迅速被诱导[30]，烟草WRKY基因会在叶片受到机械损伤的情况下过量表达[31]，基于此，我们以机械损伤和茶尺蠖取食茶树叶片来验证该基因的功能。 Erb等[32]研究發现，植食性昆虫取食植物叶片会对叶面造成机械损伤，从而引起植物的抗性反应。本试验中，茶树叶片经过机械损伤处理和茶尺蠖幼虫取食处理后CsWRKY3被迅速激活，表达水平高于对照且差异显著，并且持续表达时间较长。Skibbe等[33]的研究结果显示，烟草受到烟草天蛾幼虫取食时，NaWRKY3和NaWRKY6会激发茉莉酸途径提高烟草的抗虫性，据此我们推测CsWRKY3可能通过茉莉酸途径参与茶树对茶尺蠖的防御作用。李冉[34]的研究表明，二化螟为害水稻后OsWRKY24和OsWRKY70转录因子可以直接调控JA合成途径的关键酶基因，或者通过调节其他转录因子间接调控JA合成酶基因。胡凌飞[16]的研究表明，二化螟和褐飞虱取食水稻时，OsWRKY53、OsWRKY70可以通过调控JA、ET和SA途径来抵抗虫害。这为我们下一步深入研究CsWRKY3参与的茶树抗虫作用机制提供了思路。
本试验首次在茶树中克隆到了CsWRKY3基因，并研究了该基因在不同组织器官中的表达差异性；通过分析该基因在机械损伤和茶尺蠖幼虫取食下的表达情况，推测CsWRKY3基因参与了茶树抵抗植食性昆虫为害的防御反应，这为后期研究CsWRKY3参与茶树抗虫反应的作用机制提供了研究基础。
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