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摘要： 苔藓植物能否合成木质素目前还存在一定的争议。肉桂醇脱氢酶（CAD）催化木质素单体合成的最后一步反应，Real-Time PCR表达分析表明，小立碗藓CAD1基因在接种灰霉菌后的第2天表达量迅速上升。本试验利用PCR技术，以小立碗藓基因组DNA为模板，使用Primer 5-Cracked设计的引物，扩增出小立碗藓CAD1基因的上、下游同源臂基因片段。酶切CAD1上游同源臂和pTN182原始质粒，经连接酶连接、转化至感受态大肠杆菌，筛选出阳性株。采用裂解液裂解、质粒DNA提取、质粒PCR以及酶切进行验证，得到CAD11-pTN182。采用同样的方法把下游片段转入CAD11-pTN182，即得CAD11-pTN182-CAD12，最后进行测序分析。结果表明，已成功构建CAD11-pTN182-CAD12敲除载体，并将该重组质粒转入目的菌株大肠杆菌中保存备用，可为后续进行小立碗蘚CAD1基因敲除，验证小立碗藓CAD1基因功能，进一步了解模式植物小立碗藓防卫反应机理研究奠定良好基础。
关键词： 小立碗藓；CAD1基因；基因克隆；载体构建；酶切
中图分类号： Q782 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0059-05
苔藓植物是高等植物的低等类群，是陆生植物登陆早期的代表，含有一整套合成木质素的基因[1]，具备合成木质素的生理基础，但是苔藓植物能否合成木质素目前还存在一定的争议。小立碗藓（Physcomitrella patens）隶属葫芦藓目葫芦藓科（Funariaceae）小立碗藓属（Physcomitrium）。小立碗藓生活史中单倍体的配子体时期占优势，其整个基因序列已知，核基因组易于与有同源片段的外源DNA发生高频率的同源重组，这使得基因敲除成为可能，并且试验过程中得到的突变体即为纯合体，为基因功能的研究提供了良好的材料[2]，已经成为植物分子生物学研究的模式生物。
病原真菌和细菌感染维管束植物时，感染部位的细胞壁加厚并形成突起状结构——乳突。本试验室前期工作中发现灰霉菌感染非维管束植物小立碗藓后，小立碗藓细胞壁加厚或形成乳突结构。形成乳突是维管束植物常见的防卫反应，是限制病原体入侵的一道物理障碍，其主要成分之一为木质素，说明乳突是植物一个较为保守的抗病反应机制。木质素是一种复杂的酚类聚合物，广泛存在于高等植物中的维管束植物中[3]，苔藓植物中是否合成木质素目前还存在一定的争议。相关文献报道，苔藓植物不合成木质素，却合成木酯素或类木质素。用木质素的特异性染料高锰酸钾染色灰霉菌感染的小立碗藓样品并于电镜下观察发现，细胞壁加厚或乳突部位出现明显染色加深，说明小立碗藓在灰霉菌胁迫下可能合成了类木质素。木质素的生物合成是以苯丙酸起始，在一系列酶催化下逐步转化为木质素单体，最终聚合成木质素的过程，其中肉桂醇脱氢酶（CAD）是木质素代谢途径中第一个被研究的酶，其催化木质素单体合成的最后一步反应，将3种肉桂醛还原生成相应的3种肉桂醇[4]。本试验室前期使用 Real-Time PCR表达分析表明，小立碗藓CAD1基因在接种灰霉菌后的第2天表达量迅速上升，达到未接种对照组的17倍。综上所述，小立碗藓中可能合成了类木质素。
本试验构建小立碗藓CAD1基因的敲除载体，为后续敲除小立碗藓CAD1基因，获得CAD1基因敲除突变株，验证小立碗藓CAD1基因是否参与木质素的合成奠定基础，对揭示模式植物小立碗藓防卫反应机理有重要意义。
1 材料与方法
1.1 仪器、试剂与材料
1.1.1 仪器 电子天平，美国Denver Instrument MXX-612，TP-214；PCR仪，美国Bio-Rad Engine；电泳仪，美国Bio-Rad A101439；凝胶成像系统，美国Bio-Rad Engine；微量冷冻离心机，日本3500；超净工作台，上海博迅VS-840-2；微电脑光照培养箱，上海博迅SPX-250B-G；101A-3型电热鼓风干燥箱，上海市实验仪器总厂；YXQ-LS-75 SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司；HHS型电热恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司；十万分之一分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；TGL-16G型离心机，上海安亭科学仪器厂；85-2A恒温磁力搅拌器，金坛市科析仪器有限公司；精密酸度计，上海大普仪器有限公司。
1.1.2 试剂 引物，限制性核酸内切酶（XhoⅠ、EcoRⅤ、XbaⅠ、BamHⅠ）、Premix TaqTM 、T4-DNA连接酶、DNA Marker DL15000，大连宝生物工程有限公司；Plasmid Mini KitⅠ试剂盒，OMEGAbiotek公司；Kanamycin；测序由上海生工完成；其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 材料 小立碗藓（提取其DNA，用于扩增CAD1基因上、下游同源臂）、质粒pTN182（5 006 bp，用于构建CAD11-NPTⅡ-CAD12敲除载体）由首都师范大学提供，E. coli DH5α（用于外源基因的转化）由贵阳医学院提供。pTN182质粒模式见图1，该质粒含有NPTⅡ基因，在大肠杆菌中表现为抗卡那霉素，此外，该质粒含有2个多酶切位点，可将小立碗藓CAD1基因上、下游同源臂先后2次转入该质粒。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 （1）在GenBank中搜索出蓝桉树CAD1基因的蛋白质序列。（2）在blast中比对出相应的mRNA序列。（3）在JGI Genome Portal（http：//genome.jgi-psf.org/）通过mRNA序列比对出小立碗藓CAD1基因的DNA序列（1 624 bp）。（4）将小立碗藓CAD1基因的DNA序列均分为上、下游片段。（5）根据小立碗藓CAD1上、下游片段的DNA序列使用引物设计软Primer 5-Cracked分别设计CAD1基因上、下游片段的最佳引物与同源臂片段（上游同源臂CAD11-681 bp，下游同源臂CAD12- 650 bp）。（6）在DNAMAN软件中根据比对的基因序列在引物前添加酶切位点。（7）根据GC%添加保护碱基。（8）大连宝生物工程有限公司合成引物[5]。所合成的引物序列见表1。 1.2.2 目的基因的获取 以改良的CTAB法提取的小立碗藓基因组DNA为模板[6-7]，以CAD11-F、CAD11-R为引物进行PCR，扩增出CAD1上游同源臂CAD11；以CAD12-F、CAD12-R为引物进行PCR，扩增出CAD1下游同源臂CAD12，反应体系见表2。PCR反应条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃终延伸10 min，保存于4 ℃。扩增出目的基因片段采用乙酸钠、乙醇洗脱法进行回收，溶于无菌去离子水中，置于 -20 ℃ 保存备用[8-9]。
1.2.3 质粒的提取 将含有pTN182质粒的大肠杆菌置于LB固体培养基上37 ℃活化培养12～16 h，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37 ℃振荡过夜培养。将该培养基转移至5 mL EP管中，室温离心（12 000 r/min，1 min），去上清。采用Plasmid Mini KitⅠ试剂盒（按试剂盒说明）抽提pTN182质粒，将提取的质粒溶于无菌去离子水中保存于4 ℃冰箱。
1.2.4 CAD1-pTN182克隆载体的构建 使用XhoI、EcoRV 2种酶，分别使用同步双酶切、分步酶切方法酶切CAD1上游目的基因和pTN182原始质粒，经乙醇洗脱后使用EcoRⅤ继续酶切，酶切体系为2 μL酶、4 μL对应buffer、12 μL目的基因，使用无菌去离子水补齐至40 μL，酶切反应条件为37 ℃、3 h。取目的基因片段9 μL、质粒3 μL、连接液 12 μL于EP管中混匀，封口膜密封EP管16 ℃过夜连接[10-15]。
1.2.5 克隆载体的转化 采用CaCl2方法制作感受态大肠杆菌[16]，保存于4 ℃冰箱。取1 μL过夜连接产物，加入到感受态大肠杆菌（感受态12～24 h转化效率最高），轻旋，冰浴30 min，放入42 ℃水浴锅热激90 s，立即冰浴3 min，加入LB液体培养基1 mL，37 ℃振荡培养1 h。取800 μL转化液于含有卡那霉素（10 mg/mL）的LB固体平板培养基上，37 ℃放置20 min，待菌液完全被吸收后倒置过夜培养。
1.2.6 转化菌株的鉴定 挑取长出的单菌落，转移到新的含卡那霉素的LB固体平板培养基上并编号做进一步筛选。（1）挑取第2次在含卡那霉素的LB固体培养基上长出的单菌落将于裂解液中65 ℃裂解1.5 h，裂解产物用琼脂糖凝胶电泳与pTN182原始质粒对比验证。（2）将筛选出的菌落用LB液体培养基37 ℃振荡过夜培养，使用质粒DNA提取试剂盒提取质粒，瓊脂糖凝胶电泳与pTN182原始质粒对比验证，筛选出比原始质粒条带略高的菌落。（3）以筛选出的质粒为模板进行PCR验证，琼脂糖凝胶电泳验证是否可以得到目的条带。（4）用XhoⅠ、EcoRⅤ分步酶切验证。以插入了上游片段的pTN182重组质粒（CAD11-pTN182）为载体，采用插入上游臂方法构建插入下游片段的重组质粒（CAD11-pTN182-CAD12）。CAD1敲除载体构建过程模式见图1，以CAD11-pTN182-CAD12重组质粒为模板，使用CAD11-F、CAD12-R为引物PCR出总目的基因条带（CAD11-NPTⅡ-CAD12），送至上海生工测序。
2 结果与分析
2.1 提取出的小立碗藓基因组DNA的检测
采用改良的CTAB法提取小立碗藓基因组DNA，最后用70%的乙醇洗脱，溶于蒸馏水中于-20 ℃备用。琼脂糖凝胶电泳验证提取出的DNA。从图2可以看出，经0.7%琼脂糖凝胶电泳可看出预期的DNA条带。
2.2 PCR扩增小立碗藓CAD1基因上、下游目的基因
使用设计好的引物，以提取的小立碗藓基因组DNA为模板，PCR扩增同源臂基因片段出现了模糊的弥散条带（图3），没有出现目的基因条带。将提取的小立碗藓基因组DNA用高盐TE溶液和无水乙醇沉淀，再用70%的乙醇洗脱3遍，以此DNA为模板进行PCR扩增，从图4、图5可以看出，PCR产物经0.7%琼脂糖凝胶电泳，可以获得1条清晰明亮的特异性条带，条带大小与引物设计时设计的上、下游同源臂长度681、650 bp相符。
2.3 CAD1上游同源臂插入结果鉴定
采用裂解液裂解转化的大肠杆菌进行验证。利用裂解液裂解转化后在含卡那霉素的LB固体平板培养基上生长的大肠杆菌，裂解产物经0.7%琼脂糖凝胶电泳，可以对比出比原始质粒条带高的为插入了上游片段的质粒，进而可以筛选出对应的插入了含上游同源臂质粒的大肠杆菌。从图6可以看出，第7道的质粒比原始质粒条带略高，第7道的质粒可能已经插入了CAD1上游臂。
提取质粒验证。挑取上述第7道菌落于含卡那霉素的LB液体培养基37 ℃振荡过夜培养，用质粒DNA提取试剂盒抽提，提取出的质粒经0.7%琼脂糖凝胶电泳，与原始质粒比对，可以比对出可能插入了目的片段的菌落。从图7可以看出，第7道菌落提取出的质粒条带比原始质粒条带略高，表明第7道大肠杆菌中提取出的质粒可能已插入了小立碗藓CAD1上游臂基因。
质粒PCR验证。以上述7质粒为模板，进行PCR扩增，PCR产物经0.7%琼脂糖凝胶电泳，获得预期上游目的基因条带则该质粒可能已经插入了CAD1上游臂。以图6中第7道菌提取的质粒为模板，以CAD11-F、CAD11-R作引物进行PCR验证，PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳验证，结果（图8）表明，产生的1条特异性条带与预期上游臂片段 681 bp 相符。可能成功构建了CAD11-pTN182重组质粒。
2.4 CAD1下游同源臂插入结果鉴定
CAD1下游同源臂插入CAD11-pTN182重组质粒即得CAD11-pTN182-CAD12重组质粒。验证方法同上。 裂解法验证。由图9可知，第3、4、6、7、9道的质粒比CAD11-pTN182重质粒条带略高，有可能第3、4、6、7、9道的质粒已经插入了CAD1下游同源臂。
提取质粒验证。挑取第3、4、6、7、9道的菌落于含卡那霉素的LB液体培养基37 ℃振荡过夜培养，进一步提取质粒验证。从图10可以看出，第9道菌落提取出的质粒条带比CAD11-pTN182重组质粒条带略高，表明第9道大肠杆菌中提取出的质粒可能已插入了小立碗藓CAD1下游臂。
质粒PCR验证。以图7中第9道菌提取的质粒为模板见图11，以CAD12-F、CAD12-R作引物进行PCR验证，出来1条特异性条带，与预期下游臂片段650 bp相符。可能成功構建了CAD11-pTN182-CAD12重组质粒。
2.5 CAD11-pTN182-CAD12重组质粒鉴定
质粒PCR验证。以第9道菌提取出的质粒为模板，CAD11-F、CAD12-R为引物，PCR出总目的基因条带（上游臂681 bp，下游臂650 bp，NPTⅡ基因约2 000 bp，总目的基因条带约3 300 bp）（图12）。经0.7%琼脂糖凝胶电泳，可以看到3 300 bp左右的特异性条带，与预期的3 300 bp条带相符。
酶切验证。 图1中构建好的CAD11-pTN182-CAD12重组质粒，AB（681 bp）为插入的CAD1上游臂，CD（650 bp）为插入的CAD1下游臂，B′C′（2 114 bp）为选择标记基因NPTⅡ基因，BB′、CC′为酶切位点与NPTⅡ基因连接片段。酶切验证电泳见图13，单酶切原始质粒、CAD11-pTN182重组质粒、CAD11-pTN182-CAD12重组质粒（1、2、3），条带依次略高。用XhoⅠ、XbaⅠ酶切可能含有上下游片段的质粒（4），可得到2条约为2 700、3 700 bp的条带。用XhoⅠ、BamHⅠ酶切可能含有上下游臂的质粒（5）可得到2条约3 000、3 300 bp 的条带。用XhoⅠ、EcoRⅤ酶切可能含有上游臂的质粒（6）可能含有上下游臂的质粒可得到2条约681、5 000 bp 的条带。用XbaⅠ、BamHⅠ酶切可能含有上下游臂的质粒（7）可得到2条约650、5 700 bp的条带。从图13可以看出，酶切得到的条带与预期结果相符，说明原始质粒中插入了CAD1上、下游同源臂。
测序验证。取PCR出的总目的基因拿到大连宝生物工程有限公司进行测序，测序出来的结果用DNAMAN软件与设计的目的片段比对，比对结果见图14。比对结果显示9905%互补配对，可能在BB′、CC′接口处会出现一些小的误差，测序结果表明，插入了CAD1上下游同源臂，敲除载体构建成功。
3 讨论及结论
本试验将CAD1基因的上、下游同源臂分别插入到含2个多酶切位点的pTN182质粒。以改良的CTAB法提取的小立碗藓基因组DNA为模板，使用引物设计软件设计的小立碗藓CAD1基因上、下游同源臂的引物，利用PCR技术扩增出小立碗藓CAD1基因的上、下游同源臂。使用XhoⅠ、EcoRV 2种酶，酶切CAD1上游同源臂和pTN182原始质粒，T4DNA连接酶过夜连接，连接产物转化至感受态大肠杆菌，用含卡那霉素的LB固体平板培养基筛选阳性株，之后采用裂解液裂解、质粒DNA提取、质粒PCR以及酶切进行验证。下游同源臂的构建采用同样的方法，最后进行测序分析。结果表明，已成功构建了CAD1基因敲除载体。
本试验过程当中，采用改良的CTAB方法提取小立碗藓基因组DNA，用70%乙醇洗脱1遍。以此DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经0.7%琼脂糖凝胶电泳，没有出现预期的681、650 bp目的基因条带，而是在300 bp左右出现弥散带[17]。改变DNA模板与引物的比例，仍出现同样的弥散带。在试验过程中发现提取的DNA溶于水后，该溶液略微发黄并有黏稠感，分析可能是以下原因影响了后续PCR反应[18]：（1）提取的DNA的纯度不够，其中可能含有蛋白质、多糖和酚类等杂质。（2）DNA在溶解前可能有乙醇残留，乙醇抑制后续反应。（3）提取的DNA中可能有残留的金属离子。为排除以上因素，将提取的小立碗藓基因组DNA用高盐TE溶液和无水乙醇沉淀，于-20 ℃沉淀1 h后离心，再用70%的乙醇洗脱3遍，从而去除混在DNA中的杂质，于超净工作台吹风晾干，让乙醇充分挥发（不要过分干燥，以免DNA断裂）后再加水溶解DNA。以此DNA为模板进行PCR扩增，可以得到目的基因。因此，在提取DNA时，应将蛋白质、多糖和酚类杂质洗脱完全，以免影响后续反应。试验前期过程中采用同步双酶切的方法酶切CAD1上游目的基因和pTN182原始质粒，经连接、转化至大肠杆菌等过程，一直未筛选出插入上游目的片段的阳性株，后改用分步酶切的方法酶切，成功筛选出插入目的基因的阳性株。说明同步双酶切没有分步酶切效率高。可能是由于每一种酶都有随酶提供的相应的最佳buffer，以保证100%的酶活性。buffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性不同。在设计引物时，虽然选择了能在最大程度上保证2种酶活性的缓冲液，但由于2种酶均在非最佳缓冲液条件下进行酶切，其效率会降低，从而影响后续的连接及转化效率。因此，在同步双酶切不成功时，可以考虑采用分步酶切的方法，提高酶切效率，为后续转化、筛选等过程奠定良好的基础。
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关键词： 小立碗藓；CAD1基因；基因克隆；载体构建；酶切
中图分类号： Q782 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2016）03-0059-05
苔藓植物是高等植物的低等类群，是陆生植物登陆早期的代表，含有一整套合成木质素的基因[1]，具备合成木质素的生理基础，但是苔藓植物能否合成木质素目前还存在一定的争议。小立碗藓（Physcomitrella patens）隶属葫芦藓目葫芦藓科（Funariaceae）小立碗藓属（Physcomitrium）。小立碗藓生活史中单倍体的配子体时期占优势，其整个基因序列已知，核基因组易于与有同源片段的外源DNA发生高频率的同源重组，这使得基因敲除成为可能，并且试验过程中得到的突变体即为纯合体，为基因功能的研究提供了良好的材料[2]，已经成为植物分子生物学研究的模式生物。
病原真菌和细菌感染维管束植物时，感染部位的细胞壁加厚并形成突起状结构——乳突。本试验室前期工作中发现灰霉菌感染非维管束植物小立碗藓后，小立碗藓细胞壁加厚或形成乳突结构。形成乳突是维管束植物常见的防卫反应，是限制病原体入侵的一道物理障碍，其主要成分之一为木质素，说明乳突是植物一个较为保守的抗病反应机制。木质素是一种复杂的酚类聚合物，广泛存在于高等植物中的维管束植物中[3]，苔藓植物中是否合成木质素目前还存在一定的争议。相关文献报道，苔藓植物不合成木质素，却合成木酯素或类木质素。用木质素的特异性染料高锰酸钾染色灰霉菌感染的小立碗藓样品并于电镜下观察发现，细胞壁加厚或乳突部位出现明显染色加深，说明小立碗藓在灰霉菌胁迫下可能合成了类木质素。木质素的生物合成是以苯丙酸起始，在一系列酶催化下逐步转化为木质素单体，最终聚合成木质素的过程，其中肉桂醇脱氢酶（CAD）是木质素代谢途径中第一个被研究的酶，其催化木质素单体合成的最后一步反应，将3种肉桂醛还原生成相应的3种肉桂醇[4]。本试验室前期使用 Real-Time PCR表达分析表明，小立碗藓CAD1基因在接种灰霉菌后的第2天表达量迅速上升，达到未接种对照组的17倍。综上所述，小立碗藓中可能合成了类木质素。
本试验构建小立碗藓CAD1基因的敲除载体，为后续敲除小立碗藓CAD1基因，获得CAD1基因敲除突变株，验证小立碗藓CAD1基因是否参与木质素的合成奠定基础，对揭示模式植物小立碗藓防卫反应机理有重要意义。
1 材料与方法
1.1 仪器、试剂与材料
1.1.1 仪器 电子天平，美国Denver Instrument MXX-612，TP-214；PCR仪，美国Bio-Rad Engine；电泳仪，美国Bio-Rad A101439；凝胶成像系统，美国Bio-Rad Engine；微量冷冻离心机，日本3500；超净工作台，上海博迅VS-840-2；微电脑光照培养箱，上海博迅SPX-250B-G；101A-3型电热鼓风干燥箱，上海市实验仪器总厂；YXQ-LS-75 SⅡ型立式压力蒸汽灭菌器，上海博讯实业有限公司；HHS型电热恒温水浴锅，上海博讯实业有限公司；十万分之一分析天平，梅特勒-托利多仪器有限公司；TGL-16G型离心机，上海安亭科学仪器厂；85-2A恒温磁力搅拌器，金坛市科析仪器有限公司；精密酸度计，上海大普仪器有限公司。
1.1.2 试剂 引物，限制性核酸内切酶（XhoⅠ、EcoRⅤ、XbaⅠ、BamHⅠ）、Premix TaqTM 、T4-DNA连接酶、DNA Marker DL15000，大连宝生物工程有限公司；Plasmid Mini KitⅠ试剂盒，OMEGAbiotek公司；Kanamycin；测序由上海生工完成；其他试剂均为国产分析纯。
1.1.3 材料 小立碗藓（提取其DNA，用于扩增CAD1基因上、下游同源臂）、质粒pTN182（5 006 bp，用于构建CAD11-NPTⅡ-CAD12敲除载体）由首都师范大学提供，E. coli DH5α（用于外源基因的转化）由贵阳医学院提供。pTN182质粒模式见图1，该质粒含有NPTⅡ基因，在大肠杆菌中表现为抗卡那霉素，此外，该质粒含有2个多酶切位点，可将小立碗藓CAD1基因上、下游同源臂先后2次转入该质粒。
1.2 方法
1.2.1 引物设计 （1）在GenBank中搜索出蓝桉树CAD1基因的蛋白质序列。（2）在blast中比对出相应的mRNA序列。（3）在JGI Genome Portal（http：//genome.jgi-psf.org/）通过mRNA序列比对出小立碗藓CAD1基因的DNA序列（1 624 bp）。（4）将小立碗藓CAD1基因的DNA序列均分为上、下游片段。（5）根据小立碗藓CAD1上、下游片段的DNA序列使用引物设计软Primer 5-Cracked分别设计CAD1基因上、下游片段的最佳引物与同源臂片段（上游同源臂CAD11-681 bp，下游同源臂CAD12- 650 bp）。（6）在DNAMAN软件中根据比对的基因序列在引物前添加酶切位点。（7）根据GC%添加保护碱基。（8）大连宝生物工程有限公司合成引物[5]。所合成的引物序列见表1。 1.2.2 目的基因的获取 以改良的CTAB法提取的小立碗藓基因组DNA为模板[6-7]，以CAD11-F、CAD11-R为引物进行PCR，扩增出CAD1上游同源臂CAD11；以CAD12-F、CAD12-R为引物进行PCR，扩增出CAD1下游同源臂CAD12，反应体系见表2。PCR反应条件：94 ℃预变性 5 min；94 ℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35个循环，72 ℃终延伸10 min，保存于4 ℃。扩增出目的基因片段采用乙酸钠、乙醇洗脱法进行回收，溶于无菌去离子水中，置于 -20 ℃ 保存备用[8-9]。
1.2.3 质粒的提取 将含有pTN182质粒的大肠杆菌置于LB固体培养基上37 ℃活化培养12～16 h，挑取单菌落接种于LB液体培养基中，37 ℃振荡过夜培养。将该培养基转移至5 mL EP管中，室温离心（12 000 r/min，1 min），去上清。采用Plasmid Mini KitⅠ试剂盒（按试剂盒说明）抽提pTN182质粒，将提取的质粒溶于无菌去离子水中保存于4 ℃冰箱。
1.2.4 CAD1-pTN182克隆载体的构建 使用XhoI、EcoRV 2种酶，分别使用同步双酶切、分步酶切方法酶切CAD1上游目的基因和pTN182原始质粒，经乙醇洗脱后使用EcoRⅤ继续酶切，酶切体系为2 μL酶、4 μL对应buffer、12 μL目的基因，使用无菌去离子水补齐至40 μL，酶切反应条件为37 ℃、3 h。取目的基因片段9 μL、质粒3 μL、连接液 12 μL于EP管中混匀，封口膜密封EP管16 ℃过夜连接[10-15]。
1.2.5 克隆载体的转化 采用CaCl2方法制作感受态大肠杆菌[16]，保存于4 ℃冰箱。取1 μL过夜连接产物，加入到感受态大肠杆菌（感受态12～24 h转化效率最高），轻旋，冰浴30 min，放入42 ℃水浴锅热激90 s，立即冰浴3 min，加入LB液体培养基1 mL，37 ℃振荡培养1 h。取800 μL转化液于含有卡那霉素（10 mg/mL）的LB固体平板培养基上，37 ℃放置20 min，待菌液完全被吸收后倒置过夜培养。
1.2.6 转化菌株的鉴定 挑取长出的单菌落，转移到新的含卡那霉素的LB固体平板培养基上并编号做进一步筛选。（1）挑取第2次在含卡那霉素的LB固体培养基上长出的单菌落将于裂解液中65 ℃裂解1.5 h，裂解产物用琼脂糖凝胶电泳与pTN182原始质粒对比验证。（2）将筛选出的菌落用LB液体培养基37 ℃振荡过夜培养，使用质粒DNA提取试剂盒提取质粒，瓊脂糖凝胶电泳与pTN182原始质粒对比验证，筛选出比原始质粒条带略高的菌落。（3）以筛选出的质粒为模板进行PCR验证，琼脂糖凝胶电泳验证是否可以得到目的条带。（4）用XhoⅠ、EcoRⅤ分步酶切验证。以插入了上游片段的pTN182重组质粒（CAD11-pTN182）为载体，采用插入上游臂方法构建插入下游片段的重组质粒（CAD11-pTN182-CAD12）。CAD1敲除载体构建过程模式见图1，以CAD11-pTN182-CAD12重组质粒为模板，使用CAD11-F、CAD12-R为引物PCR出总目的基因条带（CAD11-NPTⅡ-CAD12），送至上海生工测序。
2 结果与分析
2.1 提取出的小立碗藓基因组DNA的检测
采用改良的CTAB法提取小立碗藓基因组DNA，最后用70%的乙醇洗脱，溶于蒸馏水中于-20 ℃备用。琼脂糖凝胶电泳验证提取出的DNA。从图2可以看出，经0.7%琼脂糖凝胶电泳可看出预期的DNA条带。
2.2 PCR扩增小立碗藓CAD1基因上、下游目的基因
使用设计好的引物，以提取的小立碗藓基因组DNA为模板，PCR扩增同源臂基因片段出现了模糊的弥散条带（图3），没有出现目的基因条带。将提取的小立碗藓基因组DNA用高盐TE溶液和无水乙醇沉淀，再用70%的乙醇洗脱3遍，以此DNA为模板进行PCR扩增，从图4、图5可以看出，PCR产物经0.7%琼脂糖凝胶电泳，可以获得1条清晰明亮的特异性条带，条带大小与引物设计时设计的上、下游同源臂长度681、650 bp相符。
2.3 CAD1上游同源臂插入结果鉴定
采用裂解液裂解转化的大肠杆菌进行验证。利用裂解液裂解转化后在含卡那霉素的LB固体平板培养基上生长的大肠杆菌，裂解产物经0.7%琼脂糖凝胶电泳，可以对比出比原始质粒条带高的为插入了上游片段的质粒，进而可以筛选出对应的插入了含上游同源臂质粒的大肠杆菌。从图6可以看出，第7道的质粒比原始质粒条带略高，第7道的质粒可能已经插入了CAD1上游臂。
提取质粒验证。挑取上述第7道菌落于含卡那霉素的LB液体培养基37 ℃振荡过夜培养，用质粒DNA提取试剂盒抽提，提取出的质粒经0.7%琼脂糖凝胶电泳，与原始质粒比对，可以比对出可能插入了目的片段的菌落。从图7可以看出，第7道菌落提取出的质粒条带比原始质粒条带略高，表明第7道大肠杆菌中提取出的质粒可能已插入了小立碗藓CAD1上游臂基因。
质粒PCR验证。以上述7质粒为模板，进行PCR扩增，PCR产物经0.7%琼脂糖凝胶电泳，获得预期上游目的基因条带则该质粒可能已经插入了CAD1上游臂。以图6中第7道菌提取的质粒为模板，以CAD11-F、CAD11-R作引物进行PCR验证，PCR产物采用琼脂糖凝胶电泳验证，结果（图8）表明，产生的1条特异性条带与预期上游臂片段 681 bp 相符。可能成功构建了CAD11-pTN182重组质粒。
2.4 CAD1下游同源臂插入结果鉴定
CAD1下游同源臂插入CAD11-pTN182重组质粒即得CAD11-pTN182-CAD12重组质粒。验证方法同上。 裂解法验证。由图9可知，第3、4、6、7、9道的质粒比CAD11-pTN182重质粒条带略高，有可能第3、4、6、7、9道的质粒已经插入了CAD1下游同源臂。
提取质粒验证。挑取第3、4、6、7、9道的菌落于含卡那霉素的LB液体培养基37 ℃振荡过夜培养，进一步提取质粒验证。从图10可以看出，第9道菌落提取出的质粒条带比CAD11-pTN182重组质粒条带略高，表明第9道大肠杆菌中提取出的质粒可能已插入了小立碗藓CAD1下游臂。
质粒PCR验证。以图7中第9道菌提取的质粒为模板见图11，以CAD12-F、CAD12-R作引物进行PCR验证，出来1条特异性条带，与预期下游臂片段650 bp相符。可能成功構建了CAD11-pTN182-CAD12重组质粒。
2.5 CAD11-pTN182-CAD12重组质粒鉴定
质粒PCR验证。以第9道菌提取出的质粒为模板，CAD11-F、CAD12-R为引物，PCR出总目的基因条带（上游臂681 bp，下游臂650 bp，NPTⅡ基因约2 000 bp，总目的基因条带约3 300 bp）（图12）。经0.7%琼脂糖凝胶电泳，可以看到3 300 bp左右的特异性条带，与预期的3 300 bp条带相符。
酶切验证。 图1中构建好的CAD11-pTN182-CAD12重组质粒，AB（681 bp）为插入的CAD1上游臂，CD（650 bp）为插入的CAD1下游臂，B′C′（2 114 bp）为选择标记基因NPTⅡ基因，BB′、CC′为酶切位点与NPTⅡ基因连接片段。酶切验证电泳见图13，单酶切原始质粒、CAD11-pTN182重组质粒、CAD11-pTN182-CAD12重组质粒（1、2、3），条带依次略高。用XhoⅠ、XbaⅠ酶切可能含有上下游片段的质粒（4），可得到2条约为2 700、3 700 bp的条带。用XhoⅠ、BamHⅠ酶切可能含有上下游臂的质粒（5）可得到2条约3 000、3 300 bp 的条带。用XhoⅠ、EcoRⅤ酶切可能含有上游臂的质粒（6）可能含有上下游臂的质粒可得到2条约681、5 000 bp 的条带。用XbaⅠ、BamHⅠ酶切可能含有上下游臂的质粒（7）可得到2条约650、5 700 bp的条带。从图13可以看出，酶切得到的条带与预期结果相符，说明原始质粒中插入了CAD1上、下游同源臂。
测序验证。取PCR出的总目的基因拿到大连宝生物工程有限公司进行测序，测序出来的结果用DNAMAN软件与设计的目的片段比对，比对结果见图14。比对结果显示9905%互补配对，可能在BB′、CC′接口处会出现一些小的误差，测序结果表明，插入了CAD1上下游同源臂，敲除载体构建成功。
3 讨论及结论
本试验将CAD1基因的上、下游同源臂分别插入到含2个多酶切位点的pTN182质粒。以改良的CTAB法提取的小立碗藓基因组DNA为模板，使用引物设计软件设计的小立碗藓CAD1基因上、下游同源臂的引物，利用PCR技术扩增出小立碗藓CAD1基因的上、下游同源臂。使用XhoⅠ、EcoRV 2种酶，酶切CAD1上游同源臂和pTN182原始质粒，T4DNA连接酶过夜连接，连接产物转化至感受态大肠杆菌，用含卡那霉素的LB固体平板培养基筛选阳性株，之后采用裂解液裂解、质粒DNA提取、质粒PCR以及酶切进行验证。下游同源臂的构建采用同样的方法，最后进行测序分析。结果表明，已成功构建了CAD1基因敲除载体。
本试验过程当中，采用改良的CTAB方法提取小立碗藓基因组DNA，用70%乙醇洗脱1遍。以此DNA为模板进行PCR扩增，PCR产物经0.7%琼脂糖凝胶电泳，没有出现预期的681、650 bp目的基因条带，而是在300 bp左右出现弥散带[17]。改变DNA模板与引物的比例，仍出现同样的弥散带。在试验过程中发现提取的DNA溶于水后，该溶液略微发黄并有黏稠感，分析可能是以下原因影响了后续PCR反应[18]：（1）提取的DNA的纯度不够，其中可能含有蛋白质、多糖和酚类等杂质。（2）DNA在溶解前可能有乙醇残留，乙醇抑制后续反应。（3）提取的DNA中可能有残留的金属离子。为排除以上因素，将提取的小立碗藓基因组DNA用高盐TE溶液和无水乙醇沉淀，于-20 ℃沉淀1 h后离心，再用70%的乙醇洗脱3遍，从而去除混在DNA中的杂质，于超净工作台吹风晾干，让乙醇充分挥发（不要过分干燥，以免DNA断裂）后再加水溶解DNA。以此DNA为模板进行PCR扩增，可以得到目的基因。因此，在提取DNA时，应将蛋白质、多糖和酚类杂质洗脱完全，以免影响后续反应。试验前期过程中采用同步双酶切的方法酶切CAD1上游目的基因和pTN182原始质粒，经连接、转化至大肠杆菌等过程，一直未筛选出插入上游目的片段的阳性株，后改用分步酶切的方法酶切，成功筛选出插入目的基因的阳性株。说明同步双酶切没有分步酶切效率高。可能是由于每一种酶都有随酶提供的相应的最佳buffer，以保证100%的酶活性。buffer的组成及内切酶在不同缓冲液中的活性不同。在设计引物时，虽然选择了能在最大程度上保证2种酶活性的缓冲液，但由于2种酶均在非最佳缓冲液条件下进行酶切，其效率会降低，从而影响后续的连接及转化效率。因此，在同步双酶切不成功时，可以考虑采用分步酶切的方法，提高酶切效率，为后续转化、筛选等过程奠定良好的基础。
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