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摘要：为研究蜡样芽孢杆菌基因的转录调控特征，通过鸟枪法和蓝白斑筛选，获得57个蜡样芽孢杆菌启动子片段，并以β-半乳糖苷酶为报告基因，比较了这些启动子片段在大肠埃希菌中的转录活性。对转录活性较高的4个启动子克隆片断进行测序、序列比对、特征分析，发现这4个克隆序列具有启动子元件、核糖体结合序列特征，其中2个克隆序列在枯草芽孢杆菌也表现出活性，表明兼有蜡样芽孢杆菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌RNA聚合酶σ因子序列识别特征。
关键词：启动子；随机克隆；蜡样芽孢杆菌；枯草芽孢杆菌
中图分类号： Q933 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0025-03
收稿日期：2013-11-01
基金项目：国家自然科学基金（编号：31272416）；石河子大学高层次人才科研启动专项（编号：RCZX201137）；石河子大学优秀青年项目（编号：2012ZRKXYQ13）。
作者简介：张婷婷（1984—），女，新疆石河子人，硕士，讲师，主要从事微生物生态研究。E-mail：120978935@qq.com。
通信作者：马磊，博士，副教授，主要从事生物信息学与分子遗传研究。E-mail：mlei@shzu.edu.cn。蜡样芽孢杆菌属兼性厌氧微生物，可产生毒素引发呕吐、腹泻等肠胃疾病，严重威胁食品业[1]和饲养业。然而，蜡样芽孢杆菌也可分泌抗菌物质，抑制有害微生物生长，降解土壤中的营养成分，改良生态环境，其产生的细菌蛋白酶也可被用于麻脱胶、明胶液化、牛奶胨化、还原硝酸盐、水解淀粉等用途。虽然蜡样芽孢杆菌典型菌株（ATCC14579）基因组已完成测序[2]，但目前对蜡样芽孢杆菌基因表达调控系统的研究较少，其内在丰富的遗传资源有待开发。本研究利用蜡样芽孢杆菌（ATCC14579）基因组文库资源分离、筛选了多个蜡样芽孢杆菌启动子序列，分析了其在大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌中的转录活性及序列特征，旨在为构建高效表达系统奠定基础，也为多宿主比较研究提供途径。
1材料与方法
1.1材料
菌株Bacillus cereus ATCC14579、B.subtilis DB104、Escherichia coli DH5α购自中国典型培养物保藏中心 （CCTCC）；质粒pE（来自pUC18，携带E.coli 质粒复制区起始，E.coli rep）、pGDV1（携带B.subtilis 质粒复制区起始，B.subtilis rep）、pDL（携带β-半乳糖苷酶基因，bgaB）为石河子大学生命科学学院实验室保存；质粒pEB（E.coli-B.subtilis穿梭载体）、pEB-bgaB 为本研究构建。限制性核酸内切酶、碱性磷酸酶、T4 DNA连接酶购自Promage公司，Taq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司，质粒提取、DNA回收试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司。引物见表1。
1.2方法
1.2.1启动子探测载体的构建质粒pGDV1携带1段枯草杆菌质粒复制起始区（B.subtilis rep），通过PCR技术得到该序列（5′端设置BglⅡ位点，3′端设置SacⅠ位点）。在质粒pE基础上，在BglⅡ、SacⅠ之间插入枯草杆菌质粒复制起始区（B.subtilis rep），构建大肠埃希菌-枯草杆菌穿梭载体pEB，酶切鉴定。
5），与枯草杆菌σA（σ43）识别序列-35区、-10区有较高同源性，因此其在枯草杆菌中可能由σA起始转录。虽然C1、C2、C5可能具有同源性较高的-10区，但-35区不太典型。
3结论与讨论
本研究构建了以β-半乳糖苷酶（bgaB）[5]为报告基因，在大肠埃希菌、枯草杆菌中均能稳定复制的启动子探测载体（图1）。该载体所携带的bgaB基因不含启动子和核糖体结合序列，且在其起始密码子（ATG）上游具有多个酶切位点（NotⅠ、BamHⅠ、PstⅠ），有利于启动子序列的克隆操作。以往研究中启动子克隆载体多以抗生素和绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因，但是利用抗生素作为启动子筛选和检测指标，会因宿主菌产生的耐药性引起假阳性，检测数据高于真实值；利用绿色荧光蛋白对设备的要求比较高。bgaB对宿主细胞生长影响较小，可特异性分解X-gal生成蓝色菌落，便于筛选。
本研究应用启动子随机克隆、蓝白斑筛选、β-半乳糖苷酶酶活检测，成功获得了4个在E.coli中具有较高转录、表达活性的蜡样芽孢杆菌启动子序列，而且其中2个还能在枯草杆菌中转录和表达，因此它们具有多宿主RNA聚合酶σ因子序列识别特征。
参考文献：
[1]Monika E S，Martina F，Siegfried S，et al. Bacilus cereus，the causative agent of an emetic type of food-borne illness[J]. Molecular Nutrition & Food Research，2004，48（7）：479-487.
[2]Ivanova N，Sorokin A，Anderson I，et al. Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis[J]. Nature，2003，423（6935）：87-91.
[3]Yuan G，Wong S L. Regulation of groE expression in Bacillus subtilis：the involvement of the sigma A-like promoter and the roles of the inverted repeat sequence （CIRCE）[J]. Journal of Bacteriology，1995，177（19）：5427-5433.
[4]Cutting S，Vander H. Genetic analysis，in C. R. harwood and S. M. cutting （ed.），molecular biological methods for Bacillus[M]. Chichester：John Wiley，1990：24-27.
[5]Hirata H，Fukazawa T，Negoro S，et al. Structure of a beta-galactosidase gene of Bacillus stearothermophilus[J]. Journal of Bacteriology，1986，166（3）：722-727.
关键词：启动子；随机克隆；蜡样芽孢杆菌；枯草芽孢杆菌
中图分类号： Q933 文献标志码： A 文章编号：1002-1302（2014）04-0025-03
收稿日期：2013-11-01
基金项目：国家自然科学基金（编号：31272416）；石河子大学高层次人才科研启动专项（编号：RCZX201137）；石河子大学优秀青年项目（编号：2012ZRKXYQ13）。
作者简介：张婷婷（1984—），女，新疆石河子人，硕士，讲师，主要从事微生物生态研究。E-mail：120978935@qq.com。
通信作者：马磊，博士，副教授，主要从事生物信息学与分子遗传研究。E-mail：mlei@shzu.edu.cn。蜡样芽孢杆菌属兼性厌氧微生物，可产生毒素引发呕吐、腹泻等肠胃疾病，严重威胁食品业[1]和饲养业。然而，蜡样芽孢杆菌也可分泌抗菌物质，抑制有害微生物生长，降解土壤中的营养成分，改良生态环境，其产生的细菌蛋白酶也可被用于麻脱胶、明胶液化、牛奶胨化、还原硝酸盐、水解淀粉等用途。虽然蜡样芽孢杆菌典型菌株（ATCC14579）基因组已完成测序[2]，但目前对蜡样芽孢杆菌基因表达调控系统的研究较少，其内在丰富的遗传资源有待开发。本研究利用蜡样芽孢杆菌（ATCC14579）基因组文库资源分离、筛选了多个蜡样芽孢杆菌启动子序列，分析了其在大肠埃希菌和枯草芽孢杆菌中的转录活性及序列特征，旨在为构建高效表达系统奠定基础，也为多宿主比较研究提供途径。
1材料与方法
1.1材料
菌株Bacillus cereus ATCC14579、B.subtilis DB104、Escherichia coli DH5α购自中国典型培养物保藏中心 （CCTCC）；质粒pE（来自pUC18，携带E.coli 质粒复制区起始，E.coli rep）、pGDV1（携带B.subtilis 质粒复制区起始，B.subtilis rep）、pDL（携带β-半乳糖苷酶基因，bgaB）为石河子大学生命科学学院实验室保存；质粒pEB（E.coli-B.subtilis穿梭载体）、pEB-bgaB 为本研究构建。限制性核酸内切酶、碱性磷酸酶、T4 DNA连接酶购自Promage公司，Taq DNA聚合酶、LA Taq DNA聚合酶购自宝生物工程（大连）有限公司，质粒提取、DNA回收试剂盒购自杭州维特洁生化技术有限公司。引物见表1。
1.2方法
1.2.1启动子探测载体的构建质粒pGDV1携带1段枯草杆菌质粒复制起始区（B.subtilis rep），通过PCR技术得到该序列（5′端设置BglⅡ位点，3′端设置SacⅠ位点）。在质粒pE基础上，在BglⅡ、SacⅠ之间插入枯草杆菌质粒复制起始区（B.subtilis rep），构建大肠埃希菌-枯草杆菌穿梭载体pEB，酶切鉴定。
5），与枯草杆菌σA（σ43）识别序列-35区、-10区有较高同源性，因此其在枯草杆菌中可能由σA起始转录。虽然C1、C2、C5可能具有同源性较高的-10区，但-35区不太典型。
3结论与讨论
本研究构建了以β-半乳糖苷酶（bgaB）[5]为报告基因，在大肠埃希菌、枯草杆菌中均能稳定复制的启动子探测载体（图1）。该载体所携带的bgaB基因不含启动子和核糖体结合序列，且在其起始密码子（ATG）上游具有多个酶切位点（NotⅠ、BamHⅠ、PstⅠ），有利于启动子序列的克隆操作。以往研究中启动子克隆载体多以抗生素和绿色荧光蛋白（GFP）为报告基因，但是利用抗生素作为启动子筛选和检测指标，会因宿主菌产生的耐药性引起假阳性，检测数据高于真实值；利用绿色荧光蛋白对设备的要求比较高。bgaB对宿主细胞生长影响较小，可特异性分解X-gal生成蓝色菌落，便于筛选。
本研究应用启动子随机克隆、蓝白斑筛选、β-半乳糖苷酶酶活检测，成功获得了4个在E.coli中具有较高转录、表达活性的蜡样芽孢杆菌启动子序列，而且其中2个还能在枯草杆菌中转录和表达，因此它们具有多宿主RNA聚合酶σ因子序列识别特征。
参考文献：
[1]Monika E S，Martina F，Siegfried S，et al. Bacilus cereus，the causative agent of an emetic type of food-borne illness[J]. Molecular Nutrition & Food Research，2004，48（7）：479-487.
[2]Ivanova N，Sorokin A，Anderson I，et al. Genome sequence of Bacillus cereus and comparative analysis with Bacillus anthracis[J]. Nature，2003，423（6935）：87-91.
[3]Yuan G，Wong S L. Regulation of groE expression in Bacillus subtilis：the involvement of the sigma A-like promoter and the roles of the inverted repeat sequence （CIRCE）[J]. Journal of Bacteriology，1995，177（19）：5427-5433.
[4]Cutting S，Vander H. Genetic analysis，in C. R. harwood and S. M. cutting （ed.），molecular biological methods for Bacillus[M]. Chichester：John Wiley，1990：24-27.
[5]Hirata H，Fukazawa T，Negoro S，et al. Structure of a beta-galactosidase gene of Bacillus stearothermophilus[J]. Journal of Bacteriology，1986，166（3）：722-727.