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摘要：目的 观察补阳还五汤精简方对局灶性脑缺血大鼠脑谷胱甘肽抗氧化系统的影响，探讨其作用机制。方法 将120只SD大鼠采用随机数字表法分成假手术组、模型组、补阳还五汤组、补阳还五汤精简方组。除假手术组外，其余各组采用大脑中动脉线栓法建立局灶性脑缺血模型，造模2 h后，各给药组给予相应药物灌胃，假手术组、模型组给予等量生理盐水灌胃。各组分别于脑缺血后1、3、7 d检测脑组织还原型谷胱甘肽（GSH）含量、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）活性。同时，采用实时荧光定量PCR、Western blot检测大鼠脑缺血后γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）mRNA和蛋白的表达。结果 与假手术组比较，模型组脑组织GSH含量及GSH-Px活性明显降低（P<0.05，P<0.01），γ-GCS mRNA及蛋白表达升高，其中第1日最明显（P<0.05）；与模型组比较，各给药组多能不同程度升高GSH含量及GSH-Px活性，同时上调γ-GCS mRNA及蛋白表达，其中第3日差异有统计学意义（P<0.05）。结论 补阳还五汤精简方通过调控脑缺血后谷胱甘肽抗氧化系统中GSH、GSH-Px及γ-GCS的表达，发挥抗氧化作用。
关键词：补阳还五汤精简方；局灶性脑缺血；氧化应激；还原型谷胱甘肽；谷胱甘肽过氧化物酶；γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）01-0058-04
基金项目：国家重点基础研究发展计划（2012CB723503）；湖南省科技计划项目（2013SK3107）；湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培基地开放基金（ZYFT201302）
通讯作者：王宇红，E-mail：573643177@qq.com
缺血性脑血管病具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点，现代研究表明，氧化应激是缺血性脑损伤的主要病理生理学机制之一[1]，谷胱甘肽抗氧化系统是体内重要的抗氧化应激防御系统，主要由还原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等组成，具有抗氧化、抗炎、抗氧化应激以及保护血管内皮细胞的功能。补阳还五汤精简方（以下简称“精简方”）是在多年临床经验的基础上，遵循补阳还五汤之方义，基于益气祛瘀生新法精简方药，并且配合醇提、超临界CO2提取工艺制备而成。前期实验对精简方进行最佳给药剂量筛选，结果表明精简方2.41 g/（kg·d）剂量可显著改善其神经功能缺失症状，恢复体质量，减小脑梗死面积，减轻脑组织水肿[2]。本研究观察该剂量精简方对大鼠脑缺血损伤后不同时点GSH含量、GSH-Px活性及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）表达的影响，探讨其作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级SD大鼠，体质量250～280 g，雄性，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK（京）2012-0001。
1.2 药物
补阳还五汤由黄芪120 g、当归6 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、红花3 g、桃仁3 g、地龙3 g组成，其精简方由黄芪30 g、川芎9 g、地龙6 g组成。上述药物按传统水煎法浓缩干燥后制备成干浸膏，相当于原药材4.5 g/g。干浸膏均由湖南中医研究院中药所张水寒教授提供。
1.3 主要试剂
GSH（批号20120615）、GSH-Px（批号20120703）试剂盒，南京建成生物工程研究所；GAPDH（批号5471），CST生物科技公司；羊抗大鼠γ-GCS抗体（批号Ab59956），Abcam生物科技公司；Trizol试剂盒（批号15596-026），invitrogen生物科技公司；SYBRGreen PCR试剂盒（批号F-415XL）、反转录试剂盒（批号#K1622），Thermo科技有限公司。
1.4 主要仪器
可见分光光度仪，北京普析通用仪器有限责任公司；LGl0-3A型高速离心机，北京医用离心机厂；AT.858型自动酶标分析仪，上海安泰分析仪器有限公司；2400PCR扩增仪（PE）、实时荧光定量PCR仪，美国BIO-RAD公司；芬兰雷勃酶标仪（型号MK3）、电泳仪（型号mini protean 3 cell），BIO-RAD公司；电转仪PS-9，大连竞迈科技有限公司。
2 实验方法
2.1 造模
参考改良Nagasawa线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型[3]，假手术组仅切开皮肤、分离左侧颈总动脉后随即缝合。动物清醒2 h后参照Longal[4]及Bedersont[5]的5分制法进行神经功能评分，分值在1～3分者入组。评分越高，神经功能缺损越严重。剔除标准：评分低于1分；蛛网膜下腔出血；HE染色无脑缺血病理改变；未到时间点死亡。因大鼠死亡等致样本量不足时随机替补。
2.2 分组与给药
将大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组（BYHWD组）、精简方组，每组30只，每组按3个时间点分别于首次给药后1、3、7 d处死，每个时间点10只。给药组于术后2 h开始给药，BYHWD组按成人等效剂量3.15 g/（kg·d）、精简方组2.41 g/（kg·d）药液灌胃。给药体积0.05 mL/kg。模型组和假手术组均给予等体积生理盐水。
2.3 大鼠脑组织还原型谷胱甘肽含量及谷胱甘肽过氧化物酶活性测定
取视交叉前皮层脑组织，以PBS制成10%匀浆液， 4 ℃、3500 r/min离心15 min，取上清液，按试剂盒说明书进行脑组织GSH含量（酶标法）及GSH-Px活性（比色法）的测定。
2.4 大鼠脑组织γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因表达测定
大鼠麻醉后断头处死，在冰盘上快速取出大鼠海马，按Trizol试剂盒说明书的步骤提取总RNA，通过紫外分光光度计测定RNA浓度，电泳查看RNA的完整性。按照反转录试剂盒合成cDNA，反转录反应体系（25 μL）包括RNA-Primer Mix（12 μL）、5×RT Reaction Buffer（5 μL）、25 mmol/L dNTPs（1 μL）、25 U/μL RNase Inhibitor（1 μL）、200 U/μL M-MLV Rtase（1 μL）、Oligo（1 μL）、ddH2O（DNase-free，4 μL），37 ℃、60 min， 85 ℃、5 min，4 ℃、5 min，灭活MMLV。将制备好的cDNA进行PCR扩增，PCR扩增所用的寡核苷酸物序列（见表1）由上海生工生物工程公司合成。PCR扩增反应体系（25 μL）：SYBR Green Mix （12.5 μL）、上游引物F（0.5 μL）、下游引物R（0.5 μL）、ddH2O（9.5 μL）、cDNA模板（2 μL）。反应条件：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s；60 ℃、1 min；95 ℃、15 s；60 ℃、15 s（40个循环）。使用ABI 7500 型荧光定量PCR仪采集待测基因及内参照DAPDH扩增各循环荧光信号引物。反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线，采用2-ΔΔCt计算目的基因（γ-GCS）的相对表达量。 2.5 大鼠脑组织γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶蛋白表达测定
取100 mg脑组织，按说明书提取并测定蛋白含量，取蛋白样品与4×SDS凝胶上样缓冲液混合后煮沸变性，SDS-PAGE电泳分离，湿转至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBS溶解封闭。再分别与羊抗大鼠GAPDH抗体（1∶1500）、羊抗大鼠γ-GCS抗体（1∶200）4 ℃反应过夜，TBST溶液洗3次。然后与HRP标记的二抗（1∶1000）室温孵育，以增强型HRP-DAB底物显色试剂盒显影。将膜进行扫描，图像分析软件测定目的条带的积分光密度值（IOD），以GAPDH为内参照，以目的条带IOD值与GAPDH条带IOD值的比值作为该蛋白的相对表达量。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。所有实验数据均经过方差齐性检验和正态性检验，计量资料用—x±s表示，相同时间点的比较采用独立样本t检验或方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 补阳还五汤及其精简方对大鼠脑组织还原型谷胱甘肽含量、谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响
与假手术组比较，模型组大鼠各个时间点脑组织GSH含量及GSH-Px活性明显降低（P<0.01，P<0.05）。随着动物生存时间延长，模型组指标有上升趋势，提示动物体内有一定的自身抗氧化作用。与模型组比较，各给药组第3日GSH含量及GSH-Px活性明显升高（P<0.05），精简方组第7日GSH-Px活性与同时点模型组比较差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
4.2 补阳还五汤及其精简方对大鼠脑组织γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因表达的影响
假手术组中γ-GCS mRNA呈少量表达，模型组第1日γ-GCS mRNA表达为应激性增多（P<0.05），这一结果提示早期缺血性脑损伤使GSH含量下降，而引发与GSH结合的γ-GCS的释放增加有关。精简方组及BYHWD组能不同程度上调γ-GCS mRNA表达，其中在第3日与同时点模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。精简方组和BYHWD组比较差异无统计学意义。表明给药组通过启动γ-GCS mRNA转录，上调γ-GCS mRNA的表达，催化GSH合成增多，从而发挥抗氧化作用，见表3。
4.3 补阳还五汤及其精简方对大鼠脑组织γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶蛋白表达的影响
各组大鼠缺血侧脑组织提取的蛋白均与羊抗大鼠γ-GCS抗特异性结合，在相对分子量约92 kDa处出现阳性条带。与假手术组比较，模型组及给药组γ-GCS蛋白表达量升高，第1、3日表达最明显（P<0.05，P<0.01）。精简方组第3日能上调γ-GCS蛋白表达，与同时点模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。第7日γ-GCS蛋白表达下降，各组间比较差异未见统计学意义（P>0.05）。这一趋势与γ-GCS mRNA结果大致相同，见图1。
5 讨论
由于大脑细胞具有耗氧量高、不饱和脂肪酸含量丰富、抗氧化物质储存水平较低等特点，因此极易受到氧化应激性损伤。现代研究表明，脑缺血后增强内源性抗氧化系统的活性能够减小脑组织损伤[6-7]。
GSH是一种低分子清除剂，能够清除人体内自由基，清洁和净化机体内环境，从而保护机体组织细胞免受自由基攻击。GSH是脑组织内主要的抗氧化剂，正常生理状态下浓度高达2～3 mmol/L，在许多脑部疾病中具有重要的调控作用。GSH-Px是一种重要的催化氢氧自由基分解的酶，特异地催化GSH对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。脑组织中含较多GSH-Px，脑内GSH-Px可能是防止脑细胞受到氧化损伤物质之一。因此，GSH含量及GSH-Px活性是衡量脑抗氧化能力大小的重要因素，选择这2个指标来反映脑缺血性损伤后自由基的氧化和抗自由基氧化的水平是有一定针对性的。本研究中，缺血性脑损伤使GSH含量和GSH-Px活性表达下降，清除自由基能力下降，呈现氧化应激状态，随着生存时间延长，模型组各指标略有上升，提示动物体内存在有一定抗氧化功能。
γ-GCS是机体合成GSH的限速酶，由具有调节活性的GCS轻亚单位（GCSL）和具有催化活性的GCS重亚单位（GCSh）两部分组成。增加γ-GCS的含量和活性，可以促进GSH的合成，增强组织细胞抗氧化应激的能力，因此，γ-GCS的转录和表达水平反映了机体的抗氧化能力。生理状况下细胞液中80%的γ-GCS蛋白由于和GSH结合而没有活性，GSH减少可引发与GSH结合的γ-GCS的释放增加，激活的γ-GCS增多。本研究显示，精简方能不同程度提高脑组织GSH含量、GSH-Px活性，增强谷胱甘肽抗氧化系统活性，减轻氧化应激性脑损伤，同时上调γ-GCS mRNA及蛋白表达，催化GSH合成增多，促进机体GSH、GSH-Px维持在一相对较高的平衡状态，这可能是其抗脑缺血后氧化应激的作用机制之一。这一结果为精简方用于防治脑缺血性氧化应激性损伤的后续研究提供了导向。
参考文献：
[1] Niizuma K， Endo H， Chan PH. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction as determinants of ischemic neuronal death and survival[J]. J Neurochem，2009，109：133-138.
[2] 夏相宜，刘芳，佘颜，等.脑健胶囊对MCAO大鼠脑水肿及梗死面积的影响[J].中医学报，2014，29（4）：532-534.
[3] Nagasawa H， Kogure K. Correlation between cerebral blood and histologic changes in a new rat model of cerebral artery occlusion stroke[J]. Stroke，1989，20：1037.
[4] Longa EZ， Weinstein PR， Carlson S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke，1989，20（1）：84-91.
[5] Bederson JB， Pitts LH， Tsuji M， et al. Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination[J]. Stroke，1986，17（3）：472-476.
[6] Schreibelt G， van Horssen J， van Rossum S， et al. Therapeutic potential and biological role of endogenous antioxidant enzymes in multiple sclerosis pathology[J]. Brain Res Rev，2007，56（2）：322.
[7] Shih AY， Li P， Murphy TH. A small-molecule-inducible Nrf2- mediated antioxidant response provides effective prophylaxis against cerebral ischemia in vivo[J]. Neurosci，2005，2（5）：10321- 10335.
（收稿日期：2014-05-22；编辑：华强）
关键词：补阳还五汤精简方；局灶性脑缺血；氧化应激；还原型谷胱甘肽；谷胱甘肽过氧化物酶；γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶；大鼠
中图分类号：R285.5 文献标识码：A 文章编号：1005-5304（2015）01-0058-04
基金项目：国家重点基础研究发展计划（2012CB723503）；湖南省科技计划项目（2013SK3107）；湖南省中药粉体与创新药物省部共建国家重点实验室培基地开放基金（ZYFT201302）
通讯作者：王宇红，E-mail：573643177@qq.com
缺血性脑血管病具有高发病率、高致残率、高死亡率的特点，现代研究表明，氧化应激是缺血性脑损伤的主要病理生理学机制之一[1]，谷胱甘肽抗氧化系统是体内重要的抗氧化应激防御系统，主要由还原型谷胱甘肽（GSH）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSH-Px）等组成，具有抗氧化、抗炎、抗氧化应激以及保护血管内皮细胞的功能。补阳还五汤精简方（以下简称“精简方”）是在多年临床经验的基础上，遵循补阳还五汤之方义，基于益气祛瘀生新法精简方药，并且配合醇提、超临界CO2提取工艺制备而成。前期实验对精简方进行最佳给药剂量筛选，结果表明精简方2.41 g/（kg·d）剂量可显著改善其神经功能缺失症状，恢复体质量，减小脑梗死面积，减轻脑组织水肿[2]。本研究观察该剂量精简方对大鼠脑缺血损伤后不同时点GSH含量、GSH-Px活性及γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶（γ-GCS）表达的影响，探讨其作用机制。
1 实验材料
1.1 动物
SPF级SD大鼠，体质量250～280 g，雄性，北京维通利华实验动物技术有限公司，动物合格证号：SCXK（京）2012-0001。
1.2 药物
补阳还五汤由黄芪120 g、当归6 g、赤芍4.5 g、川芎3 g、红花3 g、桃仁3 g、地龙3 g组成，其精简方由黄芪30 g、川芎9 g、地龙6 g组成。上述药物按传统水煎法浓缩干燥后制备成干浸膏，相当于原药材4.5 g/g。干浸膏均由湖南中医研究院中药所张水寒教授提供。
1.3 主要试剂
GSH（批号20120615）、GSH-Px（批号20120703）试剂盒，南京建成生物工程研究所；GAPDH（批号5471），CST生物科技公司；羊抗大鼠γ-GCS抗体（批号Ab59956），Abcam生物科技公司；Trizol试剂盒（批号15596-026），invitrogen生物科技公司；SYBRGreen PCR试剂盒（批号F-415XL）、反转录试剂盒（批号#K1622），Thermo科技有限公司。
1.4 主要仪器
可见分光光度仪，北京普析通用仪器有限责任公司；LGl0-3A型高速离心机，北京医用离心机厂；AT.858型自动酶标分析仪，上海安泰分析仪器有限公司；2400PCR扩增仪（PE）、实时荧光定量PCR仪，美国BIO-RAD公司；芬兰雷勃酶标仪（型号MK3）、电泳仪（型号mini protean 3 cell），BIO-RAD公司；电转仪PS-9，大连竞迈科技有限公司。
2 实验方法
2.1 造模
参考改良Nagasawa线栓法复制大鼠局灶性脑缺血模型[3]，假手术组仅切开皮肤、分离左侧颈总动脉后随即缝合。动物清醒2 h后参照Longal[4]及Bedersont[5]的5分制法进行神经功能评分，分值在1～3分者入组。评分越高，神经功能缺损越严重。剔除标准：评分低于1分；蛛网膜下腔出血；HE染色无脑缺血病理改变；未到时间点死亡。因大鼠死亡等致样本量不足时随机替补。
2.2 分组与给药
将大鼠随机分为假手术组、模型组、补阳还五汤组（BYHWD组）、精简方组，每组30只，每组按3个时间点分别于首次给药后1、3、7 d处死，每个时间点10只。给药组于术后2 h开始给药，BYHWD组按成人等效剂量3.15 g/（kg·d）、精简方组2.41 g/（kg·d）药液灌胃。给药体积0.05 mL/kg。模型组和假手术组均给予等体积生理盐水。
2.3 大鼠脑组织还原型谷胱甘肽含量及谷胱甘肽过氧化物酶活性测定
取视交叉前皮层脑组织，以PBS制成10%匀浆液， 4 ℃、3500 r/min离心15 min，取上清液，按试剂盒说明书进行脑组织GSH含量（酶标法）及GSH-Px活性（比色法）的测定。
2.4 大鼠脑组织γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因表达测定
大鼠麻醉后断头处死，在冰盘上快速取出大鼠海马，按Trizol试剂盒说明书的步骤提取总RNA，通过紫外分光光度计测定RNA浓度，电泳查看RNA的完整性。按照反转录试剂盒合成cDNA，反转录反应体系（25 μL）包括RNA-Primer Mix（12 μL）、5×RT Reaction Buffer（5 μL）、25 mmol/L dNTPs（1 μL）、25 U/μL RNase Inhibitor（1 μL）、200 U/μL M-MLV Rtase（1 μL）、Oligo（1 μL）、ddH2O（DNase-free，4 μL），37 ℃、60 min， 85 ℃、5 min，4 ℃、5 min，灭活MMLV。将制备好的cDNA进行PCR扩增，PCR扩增所用的寡核苷酸物序列（见表1）由上海生工生物工程公司合成。PCR扩增反应体系（25 μL）：SYBR Green Mix （12.5 μL）、上游引物F（0.5 μL）、下游引物R（0.5 μL）、ddH2O（9.5 μL）、cDNA模板（2 μL）。反应条件：95 ℃、10 min；95 ℃、15 s；60 ℃、1 min；95 ℃、15 s；60 ℃、15 s（40个循环）。使用ABI 7500 型荧光定量PCR仪采集待测基因及内参照DAPDH扩增各循环荧光信号引物。反应结束后确认实时荧光定量PCR的扩增曲线和融解曲线，进行PCR定量时制作标准曲线，采用2-ΔΔCt计算目的基因（γ-GCS）的相对表达量。 2.5 大鼠脑组织γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶蛋白表达测定
取100 mg脑组织，按说明书提取并测定蛋白含量，取蛋白样品与4×SDS凝胶上样缓冲液混合后煮沸变性，SDS-PAGE电泳分离，湿转至PVDF膜上，用含5%脱脂奶粉的TBS溶解封闭。再分别与羊抗大鼠GAPDH抗体（1∶1500）、羊抗大鼠γ-GCS抗体（1∶200）4 ℃反应过夜，TBST溶液洗3次。然后与HRP标记的二抗（1∶1000）室温孵育，以增强型HRP-DAB底物显色试剂盒显影。将膜进行扫描，图像分析软件测定目的条带的积分光密度值（IOD），以GAPDH为内参照，以目的条带IOD值与GAPDH条带IOD值的比值作为该蛋白的相对表达量。
3 统计学方法
采用SPSS17.0统计软件进行分析。所有实验数据均经过方差齐性检验和正态性检验，计量资料用—x±s表示，相同时间点的比较采用独立样本t检验或方差分析。P<0.05表示差异有统计学意义。
4 结果
4.1 补阳还五汤及其精简方对大鼠脑组织还原型谷胱甘肽含量、谷胱甘肽过氧化物酶活性的影响
与假手术组比较，模型组大鼠各个时间点脑组织GSH含量及GSH-Px活性明显降低（P<0.01，P<0.05）。随着动物生存时间延长，模型组指标有上升趋势，提示动物体内有一定的自身抗氧化作用。与模型组比较，各给药组第3日GSH含量及GSH-Px活性明显升高（P<0.05），精简方组第7日GSH-Px活性与同时点模型组比较差异有统计学意义（P<0.05），见表2。
4.2 补阳还五汤及其精简方对大鼠脑组织γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶基因表达的影响
假手术组中γ-GCS mRNA呈少量表达，模型组第1日γ-GCS mRNA表达为应激性增多（P<0.05），这一结果提示早期缺血性脑损伤使GSH含量下降，而引发与GSH结合的γ-GCS的释放增加有关。精简方组及BYHWD组能不同程度上调γ-GCS mRNA表达，其中在第3日与同时点模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。精简方组和BYHWD组比较差异无统计学意义。表明给药组通过启动γ-GCS mRNA转录，上调γ-GCS mRNA的表达，催化GSH合成增多，从而发挥抗氧化作用，见表3。
4.3 补阳还五汤及其精简方对大鼠脑组织γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶蛋白表达的影响
各组大鼠缺血侧脑组织提取的蛋白均与羊抗大鼠γ-GCS抗特异性结合，在相对分子量约92 kDa处出现阳性条带。与假手术组比较，模型组及给药组γ-GCS蛋白表达量升高，第1、3日表达最明显（P<0.05，P<0.01）。精简方组第3日能上调γ-GCS蛋白表达，与同时点模型组比较差异有统计学意义（P<0.05）。第7日γ-GCS蛋白表达下降，各组间比较差异未见统计学意义（P>0.05）。这一趋势与γ-GCS mRNA结果大致相同，见图1。
5 讨论
由于大脑细胞具有耗氧量高、不饱和脂肪酸含量丰富、抗氧化物质储存水平较低等特点，因此极易受到氧化应激性损伤。现代研究表明，脑缺血后增强内源性抗氧化系统的活性能够减小脑组织损伤[6-7]。
GSH是一种低分子清除剂，能够清除人体内自由基，清洁和净化机体内环境，从而保护机体组织细胞免受自由基攻击。GSH是脑组织内主要的抗氧化剂，正常生理状态下浓度高达2～3 mmol/L，在许多脑部疾病中具有重要的调控作用。GSH-Px是一种重要的催化氢氧自由基分解的酶，特异地催化GSH对过氧化氢的还原反应，可以起到保护细胞膜结构和功能完整的作用。脑组织中含较多GSH-Px，脑内GSH-Px可能是防止脑细胞受到氧化损伤物质之一。因此，GSH含量及GSH-Px活性是衡量脑抗氧化能力大小的重要因素，选择这2个指标来反映脑缺血性损伤后自由基的氧化和抗自由基氧化的水平是有一定针对性的。本研究中，缺血性脑损伤使GSH含量和GSH-Px活性表达下降，清除自由基能力下降，呈现氧化应激状态，随着生存时间延长，模型组各指标略有上升，提示动物体内存在有一定抗氧化功能。
γ-GCS是机体合成GSH的限速酶，由具有调节活性的GCS轻亚单位（GCSL）和具有催化活性的GCS重亚单位（GCSh）两部分组成。增加γ-GCS的含量和活性，可以促进GSH的合成，增强组织细胞抗氧化应激的能力，因此，γ-GCS的转录和表达水平反映了机体的抗氧化能力。生理状况下细胞液中80%的γ-GCS蛋白由于和GSH结合而没有活性，GSH减少可引发与GSH结合的γ-GCS的释放增加，激活的γ-GCS增多。本研究显示，精简方能不同程度提高脑组织GSH含量、GSH-Px活性，增强谷胱甘肽抗氧化系统活性，减轻氧化应激性脑损伤，同时上调γ-GCS mRNA及蛋白表达，催化GSH合成增多，促进机体GSH、GSH-Px维持在一相对较高的平衡状态，这可能是其抗脑缺血后氧化应激的作用机制之一。这一结果为精简方用于防治脑缺血性氧化应激性损伤的后续研究提供了导向。
参考文献：
[1] Niizuma K， Endo H， Chan PH. Oxidative stress and mitochondrial dysfunction as determinants of ischemic neuronal death and survival[J]. J Neurochem，2009，109：133-138.
[2] 夏相宜，刘芳，佘颜，等.脑健胶囊对MCAO大鼠脑水肿及梗死面积的影响[J].中医学报，2014，29（4）：532-534.
[3] Nagasawa H， Kogure K. Correlation between cerebral blood and histologic changes in a new rat model of cerebral artery occlusion stroke[J]. Stroke，1989，20：1037.
[4] Longa EZ， Weinstein PR， Carlson S， et al. Reversible middle cerebral artery occlusion without craniectomy in rats[J]. Stroke，1989，20（1）：84-91.
[5] Bederson JB， Pitts LH， Tsuji M， et al. Rat middle cerebral artery occlusion：evaluation of the model and development of a neurologic examination[J]. Stroke，1986，17（3）：472-476.
[6] Schreibelt G， van Horssen J， van Rossum S， et al. Therapeutic potential and biological role of endogenous antioxidant enzymes in multiple sclerosis pathology[J]. Brain Res Rev，2007，56（2）：322.
[7] Shih AY， Li P， Murphy TH. A small-molecule-inducible Nrf2- mediated antioxidant response provides effective prophylaxis against cerebral ischemia in vivo[J]. Neurosci，2005，2（5）：10321- 10335.
（收稿日期：2014-05-22；编辑：华强）