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摘 要：目的：酶法合成阿莫西林工艺优化和稳定性研究。方法：利用对羟基苯甘氨酸甲酯为侧链在青霉素酰化酶催化下，与底物6.氨基青霉烷酸f6一APA合成阿莫西林；对温度、pH、侧链与底物投料比、投酶量等条件进行优化；取化学法和酶法阿莫西林进行6个月加速实验，对比含量变化，考察成品稳定性。结果：工艺优化后阿莫西林摩尔收率达84.3%；6个月加速实验后酶法阿莫西林含量平均下降值比化学法少0.78%。结论：酶法阿莫西林工艺流程简单，方法绿色环保，杂质少，产品稳定性优于化学法。
关键词：酶法；制备阿莫西林；工艺优化
众所周知，阿莫西林是一种比较常见的口服抗生素品种，是目前生产量最大的药品之一。而阿莫西林在实际的制备合成过程中，通常采用了两种工艺方法，一种是化学法，另一种是酶法。以下本文重点对酶法制备阿莫西林的工艺的优化进行了简要的探讨分析。
1 酶法制备阿莫西林概述
1.1 阿莫西林简介
阿莫西林又名安莫西林或安默西林，化学名（2s，5R，6R）-3，3一二甲基一6一[（R）一（）一2氨基2（4～羟基苯基）乙酰氨基]7一氧代一4硫杂1一氮杂双环庚烷2一甲酸三水合物是一种最常用的青霉素类广谱p内酰胺类抗生素。阿莫西林杀菌作用强，穿透细胞壁的能力也强。是目前应用较为广泛的口服青霉素之一。
1.2 酶法阿莫西林简介
通常情况下，几乎大部分的没法耦合反应一般都是在水介质中完成的，而青霉素酰化酶将会被固定在颗粒状的载体中。一旦反应发生时，产品将会在反应作用下，迅速在溶液中结晶，并最终沉淀。其次，产品、固定化酶颗粒、母液这三者之间是相互分离的关系。并且，他们的悬浮液也会经过分样筛取以后进行分离，而无论是哪一阶段的反应过程，各方面因素的产生都会对其收率造成一定的影响。根据大量文献资料记载，相比于化学法来说，酶法制备的阿莫西林含有的杂质较少，有着很好的纯度。这是因为酶法在生产过程中，所用的原材料正是一种低粉尘性结晶的阿莫西林，能够达到十分理想的治疗效果。此外，酶法制备阿莫西林的味觉与嗅觉方面都要由于传统化学法的阿莫西林，充分保障了药品的活动成分，同时由于酶法技术法具备安全稳定性高的优点，深受制药企业的广泛青睐和应用，而且大量实验结果也证明，酶法制备的阿莫西林拥有较长的保存时间。在本研究中，我们主要是将羟基苯甘氨酸甲酯作为侧链，使其在青霉素酰化酶催化下，和底物6一APA共同形成阿莫西林。在对投酶量、温度等条件进行优化之后，最终得到了纯度较高的阿莫西林，经化验正是，酶法技术制备出的阿莫西林稳定性远远由于传统化学法的阿莫西林。
2 实验部分
2.1 实验材料
青霉素G酰化酶（自产）、对羟基苯甘氨酸甲酯（石药集团宏源化工1、6-APA（白产），其他原料均为工业级。
2.2 仪器设备
Biotech-XM酶反应器（上海宝兴公司）、HP1100高效液相分析仪、XSZ-H生物显微镜、BX.180循环冷冻机（上海宝兴公司）、pH计、电热真空干燥箱。
2.3 实验方法
2.3.1 酶法合成。将一定量的固定化青霉素G酰化酶（PGA）用无盐水清洗后投入酶反应器，通过酶反应器底部筛网排尽水分；将对羟基苯甘氨酸甲酯和6-APA按一定比例混合后加无盐水调整到反应体积，投入到酶反应器中：开启搅拌400r/min，用3mol/L氨水自动控制pH，用循环冷冻机控制温度；用HPLC检测6.APA转化率，反应初期30min取样1次，反应后期10arin取样1次，到6.APA转化率不再上升，终止反应。通过酶反应器底部筛网将阿莫西林混悬液与固定化PGA酶分离，将混悬液转移到烧杯中，冰水浴降温至5℃，缓慢滴加10%盐酸至溶液清亮，抽滤瓶抽滤，滤过液转移至烧杯中滴；JI～3mol/L氨水到少量出晶，养晶30min，继续加氨水～lJpH5.1，养晶4h，抽滤，无盐水洗，甲醇洗涤，45℃干燥。
2.3.2 稳定性试验。取相近生产日期的5组化学法和酶法阿莫西林产品进行加速实验，实验条件为：取样品30g，密封袋两层密封，40～C恒温箱放置，湿度75±10%，加速实验6个月，按药典方法检测，对比各项检测指标变化。
3 结果与讨论
3.1 合成工艺优化
实验考察了投酶量、对羟基苯甘氨酸甲酯HPGM：16-APA投料比、反应温度、反应pH等对阿莫西林合成收率的影响，其目的是找到酶法合成的最佳條件。
3.1.1 固定化青霉素酰化酶投酶量对合成收率的影响。在HPGM：6-APA=2：1，温度15℃，pH6.5条件下，投酶量分别为2.0、2.5、3.0、3.5KU/L，检测6-APA转化率，终点时取样检测阿莫西林合成收率。结果显示投酶量在2.5KU/L以上，基本可以达到最大合成反应收率，进一步提高投酶量对合成反应收率没有明显影响。
3.1.2 HPGM和6-APA投料比对合成收率的影响。在投酶量3.0KU/L，温度15℃，pH6.5条件下，HPGM：6.APA分别为1.2、1.5、1.8、2.1，检测6-APA转化率，终点时取样检测阿莫西林合成收率。结果显示HPGM：6-APA达1.5以上，可达到最大合成反应收率。
3.1.3 反应温度对合成收率的影响。投酶量3.0KU/L，HPGM：6-APA=2.0：1，pH6.5条件下，温度控制10、12、14、16、18、20℃，检N6APA转化率，终点时取样检测阿莫西林合成收率。结果显示温度控制在12～160C，可以达到相对较高的反应收率。
3.2 晶型观察
首先，我们需要称取适量的酶法阿莫西林粉末当做观察品，并将化学法的阿莫西林作作为对照品，分别将其放置显微镜下进行观察。我们在观察中发现，化学法阿莫西林中的晶型体积较小，而酶法阿莫西林却是截然相反，晶体体积较大，并且十分有规则、完整性。其次，学法阿莫西林的结晶过程主要是通过在阿莫西林水解液中加入少量的氨水，这样能够析出少量的晶体，在养晶一段时间后，需要继续添加氨水，直到PH值达到规定实验要求之后才可以停止。然而，相比于化学法阿莫西林结晶过程而言，酶法制备阿莫西林具有两次的结晶过程，当在酶法合成过程中，存在的阿莫西林晶体是与化学法中的晶体十分相似，通常在阿莫西林和酶彻底分离以后，往往要进行再次溶解，从而得出结晶，此时的结晶晶体属于重结晶。也许正是因为这一点，导致酶法阿莫西林和化学法阿莫林西在各方面产生了较大的差异。
4 讨论
一般来说，当同一种物质存在不同晶型的情况下，其在热力学方面，将会得到不同的参数。而对于药品质量来讲，这些差异性问题势必会对其稳定性产生一定的影响。并且，药物晶型的好坏也是与制剂有着密切的关联。所以在实际的药物质量控制中过程中，我们需要高度重视对其晶型的指控，这是因为化学法阿莫西林的晶型体积小于酶法阿莫西林，通常大型的晶型能够有效提高药品的流动性。其次，阿莫西林本身就是一种原材料，具有十分明显的制剂优势。另外，在实际的制剂过程中，酶法阿莫西林还具备分装收率高、粉尘少的优点。
我们在进行加速实验之后，通过得到的结果得知，酶法阿莫西林的稳定性远远高于化学法阿莫西林，因为其制剂工艺简单，能够有效减少有毒物质的使用，大大降低了三废排放率，促使酶法制备工艺逐渐向着绿色化方向发展，这样有利于促进我国经济社会的可持续发展。但是，就现行酶法制剂技术应用现状来看，其中仍旧存在一定的不足，还需要对其进一步的改造与完善，逐步提高收率，同时还要加大对酶法制备阿莫新林的推广应用，从根本上来保障药品的质量。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版二部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：401-402.
[2]王哲清.药物多晶型与有效性[J].中国医药工业杂志，2005，36（7）：442-446.
[3]P肯斯利克，V.斯特帕尼克，L.哈罗诺华，等.编码青霉素酰化酶的DNA序列，携带该序列的新型重组DNA结构及重组微生物：CN，10156345
9A[P].2009-10-21.
关键词：酶法；制备阿莫西林；工艺优化
众所周知，阿莫西林是一种比较常见的口服抗生素品种，是目前生产量最大的药品之一。而阿莫西林在实际的制备合成过程中，通常采用了两种工艺方法，一种是化学法，另一种是酶法。以下本文重点对酶法制备阿莫西林的工艺的优化进行了简要的探讨分析。
1 酶法制备阿莫西林概述
1.1 阿莫西林简介
阿莫西林又名安莫西林或安默西林，化学名（2s，5R，6R）-3，3一二甲基一6一[（R）一（）一2氨基2（4～羟基苯基）乙酰氨基]7一氧代一4硫杂1一氮杂双环庚烷2一甲酸三水合物是一种最常用的青霉素类广谱p内酰胺类抗生素。阿莫西林杀菌作用强，穿透细胞壁的能力也强。是目前应用较为广泛的口服青霉素之一。
1.2 酶法阿莫西林简介
通常情况下，几乎大部分的没法耦合反应一般都是在水介质中完成的，而青霉素酰化酶将会被固定在颗粒状的载体中。一旦反应发生时，产品将会在反应作用下，迅速在溶液中结晶，并最终沉淀。其次，产品、固定化酶颗粒、母液这三者之间是相互分离的关系。并且，他们的悬浮液也会经过分样筛取以后进行分离，而无论是哪一阶段的反应过程，各方面因素的产生都会对其收率造成一定的影响。根据大量文献资料记载，相比于化学法来说，酶法制备的阿莫西林含有的杂质较少，有着很好的纯度。这是因为酶法在生产过程中，所用的原材料正是一种低粉尘性结晶的阿莫西林，能够达到十分理想的治疗效果。此外，酶法制备阿莫西林的味觉与嗅觉方面都要由于传统化学法的阿莫西林，充分保障了药品的活动成分，同时由于酶法技术法具备安全稳定性高的优点，深受制药企业的广泛青睐和应用，而且大量实验结果也证明，酶法制备的阿莫西林拥有较长的保存时间。在本研究中，我们主要是将羟基苯甘氨酸甲酯作为侧链，使其在青霉素酰化酶催化下，和底物6一APA共同形成阿莫西林。在对投酶量、温度等条件进行优化之后，最终得到了纯度较高的阿莫西林，经化验正是，酶法技术制备出的阿莫西林稳定性远远由于传统化学法的阿莫西林。
2 实验部分
2.1 实验材料
青霉素G酰化酶（自产）、对羟基苯甘氨酸甲酯（石药集团宏源化工1、6-APA（白产），其他原料均为工业级。
2.2 仪器设备
Biotech-XM酶反应器（上海宝兴公司）、HP1100高效液相分析仪、XSZ-H生物显微镜、BX.180循环冷冻机（上海宝兴公司）、pH计、电热真空干燥箱。
2.3 实验方法
2.3.1 酶法合成。将一定量的固定化青霉素G酰化酶（PGA）用无盐水清洗后投入酶反应器，通过酶反应器底部筛网排尽水分；将对羟基苯甘氨酸甲酯和6-APA按一定比例混合后加无盐水调整到反应体积，投入到酶反应器中：开启搅拌400r/min，用3mol/L氨水自动控制pH，用循环冷冻机控制温度；用HPLC检测6.APA转化率，反应初期30min取样1次，反应后期10arin取样1次，到6.APA转化率不再上升，终止反应。通过酶反应器底部筛网将阿莫西林混悬液与固定化PGA酶分离，将混悬液转移到烧杯中，冰水浴降温至5℃，缓慢滴加10%盐酸至溶液清亮，抽滤瓶抽滤，滤过液转移至烧杯中滴；JI～3mol/L氨水到少量出晶，养晶30min，继续加氨水～lJpH5.1，养晶4h，抽滤，无盐水洗，甲醇洗涤，45℃干燥。
2.3.2 稳定性试验。取相近生产日期的5组化学法和酶法阿莫西林产品进行加速实验，实验条件为：取样品30g，密封袋两层密封，40～C恒温箱放置，湿度75±10%，加速实验6个月，按药典方法检测，对比各项检测指标变化。
3 结果与讨论
3.1 合成工艺优化
实验考察了投酶量、对羟基苯甘氨酸甲酯HPGM：16-APA投料比、反应温度、反应pH等对阿莫西林合成收率的影响，其目的是找到酶法合成的最佳條件。
3.1.1 固定化青霉素酰化酶投酶量对合成收率的影响。在HPGM：6-APA=2：1，温度15℃，pH6.5条件下，投酶量分别为2.0、2.5、3.0、3.5KU/L，检测6-APA转化率，终点时取样检测阿莫西林合成收率。结果显示投酶量在2.5KU/L以上，基本可以达到最大合成反应收率，进一步提高投酶量对合成反应收率没有明显影响。
3.1.2 HPGM和6-APA投料比对合成收率的影响。在投酶量3.0KU/L，温度15℃，pH6.5条件下，HPGM：6.APA分别为1.2、1.5、1.8、2.1，检测6-APA转化率，终点时取样检测阿莫西林合成收率。结果显示HPGM：6-APA达1.5以上，可达到最大合成反应收率。
3.1.3 反应温度对合成收率的影响。投酶量3.0KU/L，HPGM：6-APA=2.0：1，pH6.5条件下，温度控制10、12、14、16、18、20℃，检N6APA转化率，终点时取样检测阿莫西林合成收率。结果显示温度控制在12～160C，可以达到相对较高的反应收率。
3.2 晶型观察
首先，我们需要称取适量的酶法阿莫西林粉末当做观察品，并将化学法的阿莫西林作作为对照品，分别将其放置显微镜下进行观察。我们在观察中发现，化学法阿莫西林中的晶型体积较小，而酶法阿莫西林却是截然相反，晶体体积较大，并且十分有规则、完整性。其次，学法阿莫西林的结晶过程主要是通过在阿莫西林水解液中加入少量的氨水，这样能够析出少量的晶体，在养晶一段时间后，需要继续添加氨水，直到PH值达到规定实验要求之后才可以停止。然而，相比于化学法阿莫西林结晶过程而言，酶法制备阿莫西林具有两次的结晶过程，当在酶法合成过程中，存在的阿莫西林晶体是与化学法中的晶体十分相似，通常在阿莫西林和酶彻底分离以后，往往要进行再次溶解，从而得出结晶，此时的结晶晶体属于重结晶。也许正是因为这一点，导致酶法阿莫西林和化学法阿莫林西在各方面产生了较大的差异。
4 讨论
一般来说，当同一种物质存在不同晶型的情况下，其在热力学方面，将会得到不同的参数。而对于药品质量来讲，这些差异性问题势必会对其稳定性产生一定的影响。并且，药物晶型的好坏也是与制剂有着密切的关联。所以在实际的药物质量控制中过程中，我们需要高度重视对其晶型的指控，这是因为化学法阿莫西林的晶型体积小于酶法阿莫西林，通常大型的晶型能够有效提高药品的流动性。其次，阿莫西林本身就是一种原材料，具有十分明显的制剂优势。另外，在实际的制剂过程中，酶法阿莫西林还具备分装收率高、粉尘少的优点。
我们在进行加速实验之后，通过得到的结果得知，酶法阿莫西林的稳定性远远高于化学法阿莫西林，因为其制剂工艺简单，能够有效减少有毒物质的使用，大大降低了三废排放率，促使酶法制备工艺逐渐向着绿色化方向发展，这样有利于促进我国经济社会的可持续发展。但是，就现行酶法制剂技术应用现状来看，其中仍旧存在一定的不足，还需要对其进一步的改造与完善，逐步提高收率，同时还要加大对酶法制备阿莫新林的推广应用，从根本上来保障药品的质量。
参考文献
[1]国家药典委员会.中华人民共和国药典（2010年版二部）[S].北京：中国医药科技出版社，2010：401-402.
[2]王哲清.药物多晶型与有效性[J].中国医药工业杂志，2005，36（7）：442-446.
[3]P肯斯利克，V.斯特帕尼克，L.哈罗诺华，等.编码青霉素酰化酶的DNA序列，携带该序列的新型重组DNA结构及重组微生物：CN，10156345
9A[P].2009-10-21.